Генерация пациента рака простаты Производные ксенотрансплантат модели от циркулирующих опухолевых клеток

В этой рукописи подробно описан метод, используемый для получения ксенотрансплантатов (PDX) пациента с раком предстательной железы из циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК). Создание PDX-моделей на основе ЦОК обеспечивает альтернативную экспериментальную модель для изучения рака предстательной железы; Наиболее часто диагностируемая опухоль и частая причина смерти от рака у мужчин.

Общей целью данного протокола является генерация рака предстательной железы. Пациентка получала ксенотрансплантат из циркулирующих опухолевых клеток. Это достигается путем предварительного сбора периферической крови у пациентов с распространенным раком предстательной железы.

На втором этапе выделяется компартмент мононуклеарных клеток крови, в котором находятся циркулирующие опухолевые клетки. Затем мононуклеарные клетки окрашивают антителом CD 45 ZI Чтобы отобрать циркулирующие опухолевые клетки с помощью проточной цитометрии, клетки затем вводят мышам с ослабленным иммунитетом. Результаты показывают генерацию ксенотрансплантатов при раке предстательной железы на основе инъекции циркулирующих опухолевых клеток, выделенных методом проточной цитометрии из периферической крови пациентов с раком предстательной железы.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области рака предстательной железы путем создания новых экспериментальных моделей, которые могут быть использованы для молекулярной характеристики рака предстательной железы и разработки новых биомаркеров. Демонстрировать процедуру будут Уильямс, студент лаборатории, и Омада, исследователь из онкологического отделения здесь, в Маунт-Синай. Чтобы начать сбор цельной крови у отдельных пациентов с метастатическим раком предстательной железы, поскольку у них есть потенциал иметь большое количество циркулирующих опухолевых клеток в периферической крови. С помощью серологической пипетки объемом 10 миллилитров переведите цельную кровь в полистирольную коническую трубку объемом 50 миллилитров вместе с раствором соли баланса Хэнка.

В соотношении один к одному аккуратно пипетируйте смесь, чтобы она стала гомогенизированной. Затем добавьте 15 миллилитров раствора для вызова FI в пустую 50-миллилитровую полистирольную коническую трубку. Аккуратно пипеткой нанесите 20 миллилитров разбавленной цельной крови, используя самую низкую настройку поверх раствора, чтобы сформировать отчетливый верхний слой.

Затем центрифугируйте пробирку при давлении 400 G в течение 30 минут. При комнатной температуре установите замедление центрифуги на самое низкое значение, чтобы предотвратить смешивание растворов после разделения. После центрифугирования определите тонкую, белую, серую полосу мононуклеарных клеток периферической крови и циркулирующих опухолевых клеток, зажатых между верхним слоем плазмы и разделительным раствором.

На дне пробирки аккуратно соберите ячейки с белой серой полосы и перенесите их в 50-миллилитровую полистирольную трубку. С помощью пластиковой переводной пипетки добавьте пипетку Хэнка. Сбалансируйте раствор соли к выделенным клеткам на общий объем 10 миллилитров.

Снова центрифугируйте смесь при 400 G в течение 10 минут при комнатной температуре. Для того чтобы промыть клетки, удалите надосадочную жидкость и повторите эту промывку. Сделайте шаг еще раз.

После второй стирки выбросьте надосадочную жидкость. Оставшуюся гранулу суспензируйте в пяти миллилитрах буфера для лизиса эритроцитов, и выдержите раствор в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем центрифугируйте образец при давлении 400 G в течение трех минут при комнатной температуре и удалите буфер для лизиса, выбросив надосадочную жидкость.

Наконец, повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре PBS с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки перед окрашиванием. Количественно оцените количество жизнеспособных клеток с помощью стандартного метода исключения трианового синего на гемо, цитометре или автоматизированном счетчике клеток. Затем разведите клетки до 1 миллиона клеток на миллилитр в PBS с 10% FBS и поместите их на лед на один час.

Чтобы блокировать неспецифическое связывание, распределите клеточную суспензию на две отдельные пробирки. Пометьте одну пробирку для контрольных клеток и одну для CD 45 для окрашивания клеток в контрольной пробирке. Добавьте IgG один Kappa Zi в разведении от одного до 250 до конечной концентрации 10 нанограмм на миллилитр.

В CD 45 красильная трубка. Добавьте конъюгированное первичное антитело CD 45 ZI в той же концентрации 10 нанограммов на миллилитр и инкубируйте клеточные суспензии на льду в течение 30 минут. Затем центрифугируйте клетки при давлении 400 G в течение трех минут при четырех градусах Цельсия, а затем выбросьте сна.

Промойте клетки дважды, суспензировав каждую гранулу в стерильном PBS с добавлением 10% FBS с последующим центрифугированием при 400 G в течение трех минут при четырех градусах Цельсия. После промывки ревуса суспензируйте клетки в одном миллилитровом растворе PBS, содержащем 10 микрограммов на миллилитр пятнышка. Отфильтруйте конечный раствор через крышки фильтра 35 микрометров в полистирольные пробирки размером 12 на 75 миллиметров, чтобы исключить любые комки клеток или мусор.

Затем исключите CD 45-положительные клетки и мертвые клетки из суспензии с помощью сортировки флуоресцентных активированных клеток для их удаления, как описано в прилагаемом текстовом протоколе. Смешайте отсортированную суспензию клеток опухоли предстательной железы с белками внеклеточного матрикса в соотношении один к одному и положите смесь на лед. Затем обезболите полость рта мужского пола с иммунодефицитом в возрасте от 8 до 10 недель в соответствии с рекомендациями учреждения, используя 5% ингаляционного изофтора в одном литре кислорода в минуту.

Обеспечьте надлежащую анестезию, проверив потерю роговичного и пальцевого рефлекса у мыши. Наберите 250 микролитров клеточной суспензии с помощью иглы 25 калибра и одномиллилитрового шприца. Затем ввести весь объем суспензии клеток внеклеточного матрикса подкожно в оба верхних бока опухолей монитора мыши, выполняя еженедельную пальпацию мест инъекций мыши для роста подкожной плотности узлов.

Основываясь на методе отрицательного отбора, используемом в этом протоколе, необходимо исключить мертвые клетки с помощью окрашивания DAPI. Как показано здесь, процент CD 45 отрицательных клеток от остальных жизнеспособных клеток варьирует и зависит от опухолевой нагрузки пациента, но они легко отделяются от CD 45 положительных клеток. При использовании правильного гейтирования после имплантации суспензии клеток опухоли предстательной железы подкожные узелковые плотности станут заметны на обоих флангах мыши.

Каждая плотность узла представляет собой рост ксенотрансплантата и может быть оценена в отличие от здоровой ткани, поскольку она выступает из тыльной мускулатуры мыши и имеет более твердую текстуру. Полученные от пациента модели ксенотрансплантатов, полученные из циркулирующих опухолевых клеток, повторяют опухоли предстательной железы человека, как видно по окрашиванию гемата, тоина и эозина, а также с помощью иммуногистохимии для специфических клеточных маркеров предстательной железы, таких как андрогенный рецептор и специфический мембранный антиген предстательной железы. Другие протоколы, такие как профилирование экспрессии генов или белков, могут быть использованы для изучения клеточных и молекулярных механизмов, которые способствуют агрессивности рака предстательной железы.