Анализ данио рерио Личинки скелетных мышц целостности с синий краситель Эванса
30 ноября 2015 г.
В этом исследовании мы описываем простой метод проведения анализа синего красителя Эванса (EBD) на личинках рыбок данио. Этот метод является мощным инструментом для характеристики целостности скелетных мышц и определения моделей мышечной дистрофии у рыбок данио, а также ценным методом для разработки новых методов лечения.
Общая цель инъекции красителя Evans Blue и фитци-декстрина в общую кардинальную вену заключается в наблюдении за целостностью мембран скелетных мышц у живых zebrafish, что помогает охарактеризовать механизмы развития заболеваний, связанных с различными подтипами мышечной дистрофии. Инъекция красителя Evans Blue может помочь выявить биологические механизмы, способствующие патологии заболевания при характеристике моделей мышечной дистрофии на животных, а также расширить наше понимание потенциальных терапевтических механизмов лечения заболевания. Основным преимуществом данной методики является возможность ее проведения и анализа на живых zebrafish.
Кроме того, совместная инъекция Fitz Dextrin служит контролем качества успешности введения препарата, что повышает строгость и точность количественного анализа. Значимость данной методики заключается в возможности валидации моделей мышечных заболеваний на zebrafish. Она также способствует более глубокому пониманию того, как определенные мутации приводят к фенотипам мышечных патологий, таких как мышечная дистрофия, что имеет критическое значение для поиска методов лечения и способов излечения.
Для приготовления чашек с агаром для инъекций прокипятите раствор агарозы в концентрации от 2 до 3% в среде E3 и дайте раствору немного остыть при комнатной температуре. Разлейте примерно 35 мл охлажденной агарозы в каждую чашку диаметром 100 мм. Затем погрузите один край выбранной формы для инъекций в раствор, после чего уложите оставшуюся часть формы на поверхность агарозы.
Оставьте раствор агарозы затвердевать либо при комнатной температуре, либо при 4 °C в течение примерно 30 минут. Затем с помощью шпателя отделите один край формы от затвердевшего агароза и медленно извлеките оставшуюся часть формы. Приготовьте 1% стоковый раствор красителя Эванса (Evan's Blue Dye, EBD) в 1x растворе Рингера.
Затем приготовьте стоковый раствор Fitzy Dextrin в растворе Рингера (1x) и храните его при температуре -20 °C. Для приготовления инъекционной смеси разведите EBD до концентрации 0.1% непосредственно в стоковом растворе Fitz Dextrin, тщательно перемешайте смесь на вортексе и защитите от прямого света, обернув пробирку алюминиевой фольгой перед проведением инъекций. Доведите температуру инъекционной пластины до комнатной.
Разместите микроманипулятор на металлической пластине рядом со штативом инъекционного микроскопа. Включите пневматический контроллер микроинъекций. Затем заполните инъекционную иглу примерно 2–4 µL смеси EBD, втягивая раствор назад.
Затем откалибруйте объем инъекции, используя около пяти нанолитров смеси EBD. Далее смочите инъекционную пластину раствором Рингера 1x и удалите из лунок излишки раствора. Предварительно обработайте личинок 0,04% раствором трикаина, разведенным в растворе Рингера 1x, чтобы полностью иммобилизовать их перед инъекцией с помощью стеклянной пипетки. Поместите анестезированных личинок в лунки пластин для инъекций, убедившись, что личинки полностью находятся в лунках и лежат на боку.
Удалите избыток раствора trica, чтобы минимизировать перемещение личинок в лунке, но оставьте достаточное количество для предотвращения дегидратации. Поместите планшет с личинками для инъекций под стереомикроскоп и расположите иглу инъекционной пипетки, содержащую EBD. Выполните смешивание над личинкой zebrafish в области сердца, примерно под углом 45 градусов к переднезадней оси.
Введите инъекционную иглу в общую кардинальную вену (CCV) рядом с передней частью желтка, там, где вена начинает поворачивать в дорсальном направлении. Затем введите 5 нл смеси EBD и удерживайте иглу в этом положении от 5 до 8 секунд. Чтобы минимизировать немедленную утечку смеси EBD, при правильном введении краситель должен появиться в камерах сердца; при необходимости процедуру можно повторить.
Если EB DMX не наблюдается в сердце сразу после успешной инъекции, в сосудах эмбриона будет накапливаться Fitz Dextrin, как показано здесь. После того как было сделано необходимое количество инъекций личинкам, перенесите их в 100-миллиметровые чашки с раствором Ringer 1х без трика для повышения выживаемости и поддержания интенсивности сигнала. Держите чашки обернутыми в алюминиевую фольгу.
Инкубируйте личинок при 28.5 °C в течение четырех-шести часов для обеспечения эффективного поглощения EBD. Для визуализации EBD в мышцах используйте 0.04% trica для анестезии личинок перед их осмотром под красной флуоресценцией. EBD вводили в CCV гомозиготных мутантов Sapia и сиблингов дикого типа на стадии 3D PF; инъекции заполняли камеры сердца, как показано здесь, после чего проводили анализ успешной перфузии красителя путем визуализации FITC-декстрина в сосудах под зеленой флуоресценцией.
После четырехчасового периода инкубации поглощение EBD изучали на уровне сомитов, как показано на данном рисунке. У сиблингов дикого типа флуоресценция EBD в видимых мышечных волокнах отсутствовала, тогда как у гомозиготных мутантов sapia наблюдалось поглощение EBD, что указывает на повреждение мышечной мембраны. При наличии навыка инъекция красителя Эванса синего в общую кардинальную вену личинок zebrafish может быть выполнена в течение 30–60 минут, в зависимости от количества инъецируемых личинок.
Кроме того, для подтверждения квалификации экспериментальные результаты могут быть получены за один день. Важно помнить о необходимости точного попадания в кардинальную вену для получения воспроизводимых и интерпретируемых результатов. Это может быть сложно и, скорее всего, потребует практики при выполнении данной процедуры.
Для определения молекулярных механизмов, ответственных за повреждение мембран при мышечных дистрофиях, могут быть применены другие методы, такие как химический и генетический скрининг. Эти эксперименты могут помочь в разработке новых терапевтических стратегий лечения мышечных заболеваний. Данная методика открыла перед исследователями в области мышечных патологий возможность изучения целостности мембран на моделях мышечной дистрофии у zebrafish.
После просмотра этого видео вы должны в полной мере освоить методику введения красителя Эванса в общую кардинальную вену личинок zebrafish. Вы также должны научиться идентифицировать мышечные волокна с повреждением мембраны по наличию красителя Эванса внутри волокон.
Обзор
В данном исследовании представлен метод анализа с использованием красителя Эванс Блю (EBD) на личинках zebrafish, который необходим для оценки целостности скелетных мышц. Эта методика помогает в характеристике моделей мышечной дистрофии и разработке новых терапевтических средств.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронауки
- Биология мышц
- Разработка методов терапии
Теоретическая часть
- Краситель еванс блю используется для оценки целостности мышечных мембран.
- Модели Zebrafish ценны для изучения мышечной дистрофии.
- Данный метод позволяет осуществлять наблюдение за биологическими механизмами в режиме реального времени.
- Совместное введение фитц-декстрина служит мерой контроля качества.
Цель исследования
- Для изучения целостности мембран скелетных мышц у zebrafish.
- Для характеристики механизмов заболеваний, связанных с мышечной дистрофией.
- Для углубления понимания потенциальных терапевтических стратегий.
Используемые методы
- Инъекция EBD в общую кардинальную вену личинок zebrafish.
- Приготовление агаровых планшетов для инъекций и растворов EBD.
- Использование трикаина для иммобилизации личинок во время инъекции.
- Визуализация поглощения EBD с помощью флуоресцентной микроскопии.
Основные результаты
- Успешное введение EBD было подтверждено флуоресценцией в камерах сердца.
- Гомозиготные мутанты Sapia демонстрировали поглощение EBD, что указывает на повреждение мышечных мембран.
- У сиблингов дикого типа флуоресценция EBD в мышечных волокнах отсутствовала.
- Данный метод позволяет проводить экспресс-анализ большого количества личинок за один день.
Выводы
- Метод инъекции EBD эффективен для изучения целостности мышц у zebrafish.
- Данный метод может способствовать исследованиям мышечной дистрофии и потенциальных способов ее лечения.
- В дальнейших исследованиях можно изучить молекулярные механизмы мышечных заболеваний.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для отрасли
Оценка целостности мембран скелетных мышц имеет решающее значение для валидации моделей нервно-мышечных заболеваний на зебрафиш и снижения рисков при подтверждении мишеней в исследованиях мышечной дистрофии. Метод инъекции красителя Evans Blue Dye (EBD) позволяет проводить количественную оценку повреждения мембран в живом организме, что способствует механистическому снижению рисков и повышению прогностической достоверности доклинических моделей. Данный подход улучшает трансляционную преемственность, обеспечивая воспроизводимый и масштабируемый результат для терапевтического скрининга и согласования биомаркеров.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы путем визуализации повреждений мембран мышц на живых моделях нервно-мышечных заболеваний у рыб zebrafish.
- Практическая ценность: Способствует снижению биологических рисков за счет прямого наблюдения за поглощением красителя Evans Blue Dye в качестве биомаркера целостности мембран.
- Прогностическая ценность: Облегчает сортировку портфеля препаратов путем разграничения фенотипов дикого типа и мутантных форм на основе флуоресценции EBD в скелетных мышцах.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность к анализу: обеспечивает стандартизированный, воспроизводимый метод подготовки валидированных биологических систем для последующего скрининга соединений.
- Количественные данные: позволяет получать результаты на основе флуоресценции, что обеспечивает надежное сравнение целостности мембран при различных экспериментальных условиях.
- Масштабируемость: позволяет проводить быстрый анализ множества личинок за один день, что поддерживает рабочие процессы скрининга со средней пропускной способностью.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболевания: Напрямую моделирует фенотипы мышечной дистрофии путем детектирования поглощения EBD в гомозиготных мутантах sapia, что отражает механизмы заболевания у человека.
- Трансляционная преемственность: Связывает этап открытия с доклинической валидацией, предоставляя согласованную метрику целостности мембран для различных модельных систем.
- Прогресс с учетом рисков: Обосновывает решения о продолжении или прекращении разработки («go/no-go»), количественно оценивая терапевтическое восстановление поврежденных мышц в генетических или химических скринингах.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Метод инъекции EBD вписывается в общую последовательность этапов разработки — от валидации мишени до идентификации ведущих соединений, предлагая вариант анализа на живых клетках для снижения механистических рисков и терапевтического скрининга в рамках программ по изучению нервно-мышечных заболеваний.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез и уточнению сигнальных путей путем установления связи между генетическими мутациями и наблюдаемыми дефектами мышечных мембран.
- Скрининг: обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость анализа за счет совместного введения фитц-декстрина в качестве контроля качества успешной доставки.
- Аналитика: обеспечивает получение количественных показателей флуоресценции, что позволяет сравнивать поглощение EBD личинками дикого типа и мутантными личинками.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность с доклиническими исследованиями путем валидации моделей zebrafish, которые воспроизводят патологию мышечных заболеваний человека.
- Корпоративное повторное использование: создает возможность многократного применения метода для оценки целостности мембран в различных моделях нервно-мышечных заболеваний и в рамках различных кампаний по скринингу.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает прогностическую уверенность при валидации мишени за счет снижения механистической неопределенности в моделях мышечных заболеваний.
- Операционная ценность: гарантирует стандартизацию и воспроизводимость благодаря контролируемым параметрам инъекции и качественному контролю ко-инъекции.
- Стратегическая ценность: повышает эффективность использования капитала, позволяя принимать ранние решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) на основе показателей целостности мембран.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритезацию терапевтических кандидатов с учетом рисков посредством объективной количественной оценки повреждения мышц.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с Danio rerio, проведения микроинъекций и использования флуоресцентной микроскопии.
- Зависимость от микрофлюидных систем впрыскивания и инфраструктуры для флуоресцентной визуализации.
- Необходима стандартизация объема инъекций, времени инкубации и протоколов анестезии между исследовательскими группами.
- При сравнении результатов необходимо учитывать различия в линиях личинок, стадиях развития и генетическом фоне.
- Метод ограничен определением проницаемости мембран; для последующего патологического анализа требуются дополнительные тесты.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Title
1:14
Preparation of Agar Injection Plates and Evans Blue Dye Injection Mix
2:42
Evans Blue Dye Injection Preparation
3:54
Pericardial Injection and Uptake of Evans Blue Dye in Zebrafish Larvae
5:29
Results: Skeletal Muscle Analysis in Zebrafish Larvae Using Evans Blue Dye
6:14
Conclusion
