Изучение стехиометрии рецептор эпидермального фактора роста в интактных клетках, используя КОРРЕЛЯЦИОННЫМ микроскопия

Общая цель следующего эксперимента заключается в визуализации распределения и стехиометрии рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR) в плазматической мембране интактных и гидратированных клеток с помощью флуоресцентной и электронной микроскопии. Для этого сначала выращивают экспрессирующие EGFR клетки, такие как cos seven, на микрочипах с тонкой кремний-нитридной мембраной толщиной 50 nanometer, перекрывающей центральную область окна. Затем клетки инкубируют с биотинилированной версией эпидермального фактора роста, который связывается с рецептором и изменяет конформацию EGFR, что приводит к его димеризации и активации.

Затем клетки фиксируют для иммобилизации рецепторов и инкубируют с конъюгированными квантовыми точками Hagen (stripped), которые связываются с активированными EGF рецепторами, после чего проводят визуализацию клеток. В завершение проводят вторую фиксацию глутаральдегидом, которая создает поперечные связи между конъюгированными квантовыми точками Hagen (stripped) и EGFR, стабилизируя образец для электронной микроскопии. Результаты демонстрируют эмиссию красной флуоресценции при визуализации с помощью флуоресцентных квантовых точек, а также распределение EGFR, их стехиометрическое состояние или кластеризацию с помощью сканирующей просвечивающей электронной микроскопии.

Данный метод предоставляет уникальную информацию о геометрии и распределении мембранных рецепторов в интактных клетках и может быть использован для изучения активации рецептора эпидермального фактора роста в нормальных клетках и клетках рака. Его также можно применять для исследования других мембранных рецепторов, например, ионных каналов. Начните работу, находясь под вытяжным шкафом. Выполните первые этапы подготовки микрочипов с мембраной из нитрида кремния: после погружения в ацетон согласно текстовому протоколу перенесите микрочипы непосредственно в стакан с этанолом и выждите две минуты, затем извлеките чипы из этанола и поместите их на салфетку для чистых помещений.

После высыхания чипов перенесите их на предметное стекло, предварительно помещенное в чашку Петри. Затем закройте чашку крышкой. После этого поместите предметное стекло с микрочипами в установку для плазменной очистки.

Выполните стандартную пятиминутную программу очистки, чтобы сделать поверхность мембраны из нитрида кремния гидрофильной. Затем в ламинарном шкафу перенесите микрочипы со стекла. Сдвиньте их на безворсовую салфетку для чистых помещений, после чего поместите их в лунку 24-луночного планшета, заполненную раствором поли-L-лизина (PLL), и инкубируйте в течение пяти минут.

Затем поочередно перенесите микрочипы в другую лунку с водой степени чистоты HPLC, после чего промойте их в еще одной лунке с водой. В завершение поместите микрочипы по отдельности в лунки 96-луночного планшета, заполненные DM, и поместите планшет в инкубатор с CO₂ для субкультивирования семи клеток COS. Приготовьте монодисперсную клеточную суспензию с концентрацией примерно 5 × 10⁶.

пять клеток на миллилитр. Добавьте одну каплю клеточной суспензии в каждый микрочип в 96-луночном планшете и инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут с использованием инвертированного микроскопа. Приступайте к осмотру областей микрочипов, чтобы добиться приблизительной плотности от 20 до 30 клеток на окно размером 150 на 400 мкм.

После того как клетки достаточно прикрепились, осторожно перенесите микрочипы (стороной с клетками вверх) в новые лунки, содержащие dm. Когда достаточное количество клеток останется прикрепленным, перенесите микрочипы (сторонами с клетками вверх) в новые лунки, содержащие безсывороточный dmm. После этого инкубируйте микрочипы при 37 °C в CO2-инкубаторе от нескольких часов до ночи перед выполнением следующих этапов.

С помощью 96-луночного планшета заполните лунки необходимыми растворами, используя одну строку или столбец для каждого микрочипа. Промойте микрочипы, поместив их в лунку со свежим раствором B-S-A-G-E-L-P-B-S, и инкубируйте при 37 °C в течение пяти минут. Перенесите микрочипы в раствор биотинилированного EGF с концентрацией 300 nM и снова поместите их в инкубатор на три минуты, чтобы клетки начали эндоцитоз меченого EGF-EGFR.

Быстро промойте микрочипы трижды, используя PBS. Затем промойте образцы 0,1 M ката-буфером или CB. После этого перенесите микрочипы в 3% PFA и инкубируйте в течение 10 минут.

После одного промывания раствором CB и трех раз раствором PBS перенесите чипы в G-L-Y-P-B-S и инкубируйте в течение двух минут. Затем промойте дважды с помощью PBS. После этого поместите микрочипы в 10 NANOMOLAR S-T-R-Q-D на 10 минут, а затем промойте четыре раза раствором B-S-A-P-B-S.

Затем погрузите один микрочип в стеклянную чашку диаметром 35 миллиметров, предварительно заполненную B-S-A-P-B-S комнатной температуры, чтобы провести визуализацию клеток с помощью дифференциально-интерференционного контраста (DIC) и флуоресцентной микроскопии. Для получения обзорных изображений клеток, меченных QD 6 55, используйте воздушный объектив 40 x. Используйте фильтр-куб, обеспечивающий возбуждение квантовых точек в диапазоне от 340 до 380 нанометров с эмиссией выше 420 нанометров.

Минимизируйте интенсивность света, чтобы избежать слишком сильного освещения, которое может повредить образец. Установите время экспозиции не менее 300 миллисекунд, чтобы зафиксировать сигналы всех qds, так как флуоресценция QD подвержена мерцанию; отрегулируйте интенсивность света и усиление для получения ярких изображений без видимого шума при минимальной интенсивности освещения. После получения изображений поместите микрочип обратно в 96-луночный планшет с B-S-A-P-B-S.

Промойте один раз в cb, затем перенесите в 2% glutaraldehyde и инкубируйте еще в течение 10 минут. Промойте и используйте B-S-A-P-B-S для промывки микрочипа трижды; храните в лунках новой 96-луночного планшета, предварительно заполненных B-S-A-P-B-S, для каждого микрочипа. Заполните ряд из четырех лунок водой степени чистоты HPLC.

После настройки ESEM в соответствии с текстовым протоколом загрузите образец в предварительно охлажденный предметный столик ESEM STEM, достав 96-луночный планшет WAT из контейнера для охлаждения и поместив его рядом с открытым столиком ESEM. Положите рядом с ним салфетку для чистых помещений. Быстро промойте микрочип, четыре раза погрузив его на одну секунду в лунку, заполненную водой степени чистоты HPLC.

Кратковременно промокните салфеткой обратную сторону микрочипа и поместите его на предварительно охлажденный предметный столик с тремя µL охлажденной воды степени чистоты HPLC. Увлажните поверхность образца и закрепите его на столике. Затем нанесите на столик рядом с образцом еще три капли воды по 3 µL и закройте камеру для образца.

После идентификации интересующей клетки, согласно текстовому протоколу, сделайте обзорный снимок клетки с помощью STEM, переместитесь в периферийную область клетки, где видна её граница, и увеличьте масштаб до 50 000 X. Сделайте снимки, на которых видны отдельные qds, используя время dwell-сканирования пикселя от 20 до 30 микросекунд; здесь представлены QD 6 55 меченные мембранные EGFR в интактных, полностью гидратированных клетках COS семь. Снимок DIC здесь иллюстрирует топографию мембраны клеток, а соответствующее флуоресцентное изображение показывает распределение EGFR по всей поверхности клетки после трех минут инкубации с биотинилированным EGF.

Эти ESEM STEM-изображения с низким увеличением демонстрируют такие тонкие структуры, как филоподии, тянущиеся от клетки к соседним клеткам, а также некоторые структуры внутри более тонких участков клетки. Толстые центральные области клетки, включая ядро, выглядят белыми, поскольку электроны используемой энергии не могут пройти сквозь образец. Высокое разрешение.

Снимки ESEM STEM более тонких периферических областей демонстрируют метки из квантовых точек (QD) на складке мембраны, пересекающей изображение по диагонали. В нескольких местах эта мембранная структура обладает более высокой плотностью EGFR, чем окружающие участки мембраны, при этом две метки находились в непосредственной близости друг от друга. Стрелками указаны два примера с расстояниями 20 и 24 нанометра.

Данные пары меток интерпретируются как принадлежащие к EGFR. Это изображение было получено в области с более низкой плотностью EGFR и более слабым флуоресцентным сигналом. Тем не менее, EGFR также был обнаружен здесь в виде димеров, а также присутствовали два кластера по 10 или 11 EGFR.

После освоения метода подготовка образцов может быть выполнена в течение двух часов, что значительно быстрее, чем при использовании общепринятых методов электронной микроскопии. Последующая STEM-визуализация методом essem позволяет получить до 100 изображений высокого разрешения за полдня.