Используя цифровой капли ПЦР для обнаружения гена BRAF V600E Мутации в формалине фиксированной в парафин Ссылка на стандарт клеточных линиях

Общая цель данного эксперимента заключается в выделении геномной ДНК человека из формальных и фиксированных референсных стандартных клеточных линий с парафином с использованием системы подготовки тканей с последующим анализом мутаций bra V 600 E в геномной ДНК с помощью цифровой капли. P-C-R-D-D-P-C-R Может помочь ответить на ключевые вопросы молекулярной онкологии, такие как наличие и распространенность мутаций последовательности RA и количественная оценка нуклеиновой кислоты при низком числе копий матрицы. Хотя этот метод демонстрируется в AEP в качестве стандартных клеточных линий, он также может быть использован в других биологических образцах, чтобы убедиться, что вы оптимизируете условия для выделения интересующей вас ДНК.

Эта система подготовки тканей может быть использована для выделения до 48 образцов геномной ДНК человека, не содержащей загрязняющих веществ, в течение четырех часов по сравнению с другими ручными процедурами. Эта система несколько дорога в приготовлении из-за использования магнитных шариков. Тем не менее, он безопаснее и производится, а скоба высокого качества Демонстрацией давления будет ssu A и техник из нашей лаборатории.

Экстракция ДНК будет проводиться в полностью автоматизированном приборе для выделения ДНК с использованием системы подготовки тканей или протокола TPS. Начните с включения прибора и компьютера. Откройте программное обеспечение для управления спуском и вставьте лоток автоматической загрузки в зону загрузки палубы TPS.

Затем распределите реагенты по соответствующим желобам, как показано на рисунке, поместите четыре образца в штатив для носителей образцов. Обеспечьте правильное смешивание буфера для лизиса и буферов промывки, перевернув их от трех до пяти раз, а затем загрузите в соответствующие желоба в четвертой колонке. После многократного инвертирования или легкого завихрения загрузите магнитные шарики элюцианского буфера и буфер FFPE в небольшие желоба в столбце пять, оставив два слота пустыми там, где указано.

Загрузите на держатель пластины глубиной два миллилитра. Перед началом запуска UNC укупорьте все пробирки и корыта с реагентами. Убедитесь, что в бутылке для жидких отходов достаточно места и что бутылка для твердых отходов пуста и выстлана пакетом для биологически опасных веществ.

Убедитесь, что пластина для выброса наконечника расположена по центру сборки отходов. Закройте переднюю крышку, запустите программу, откройте главную звезду NA prep ML. Do med file.

Нажмите «Начать». Состояние прибора перейдет с холостого хода на рабочее. Введите количество выборок для этого прогона.

Выберите нужный метод для этого прогона. Введите положение первого большого объемного наконечника, выбрав один. Если все лотки заполнены, введите положение первого стандартного наконечника по объему, выбрав один.

Если все лотки заполнены, прибор выполнит автоматические шаги без вмешательства пользователя. Здесь подробно описан рабочий процесс, чтобы избежать загрязнения. Соблюдайте стандартные меры предосторожности, такие как ношение перчаток и использование чистого капюшона для ПЦР.

Очистите пипетки и пробирки с низким содержанием белка. Соберите реакционные смеси в полоски для ПЦР-пробирок, разморозьте и уравновесьте компоненты реакции до комнатной температуры. Образец геномной ДНК человека для анализа цифровой каплей, ПЦР или D-D-P-C-R должен иметь минимальную концентрацию 3,3 нанограмма на микролитр.

Подготовьте ПЦР-реакции. Соедините два супер X-D-D-P-C-R смешайте 20 прямых и обратных праймеров и зонд с каждым очищенным образцом ДНК и сделайте до 20 микролитров с дистиллированной водой. Тщательно перемешайте смесь для обеспечения однородности и кратковременно центрифугируйте для сбора содержимого на дне пробирок перед дозированием.

Работайте с генератором капель в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем. Вставьте картридж в держатель с выемкой в картридже, расположенном в верхней левой части держателя. Добавьте 20 микролитров реакционной смеси, содержащей образцы, в средние лунки и 70 микролитров генераторной нефти в придонные скважины.

Прикрепите прокладку к верхней части картриджа. Убедитесь, что прокладка надежно зацеплена с обоих концов держателя. В противном случае достаточное давление для образования капель не будет достигнуто.

Откройте генератор капель, нажав зеленую кнопку в верхней части прибора. Вставьте картридж, когда держатель находится в правильном положении. Индикаторы питания и держателя горят зеленым цветом.

Нажмите верхнюю кнопку на приборе еще раз, чтобы закрыть дверцу и начать генерацию капель. Через 10 секунд индикатор капель мигает зеленым цветом, указывая на то, что капля генерируется. Когда генерация капель будет завершена, все три индикатора загорятся зеленым цветом.

Откройте дверцу, нажав на кнопку, и снимите держатель с блока. Снимите одноразовую прокладку с держателя и выбросьте ее. Обратите внимание, что верхние лунки картриджа содержат капли, а средние и нижние лунки почти пусты с небольшим количеством остаточного масла после образования капель.

Подготовьтесь к обычной амплификации ПЦР. Для каждой пробирки образца было выведено 40 микролитров содержимого капель из верхней лунки картриджей в одну лунку рекомендуемой 96-луночной ПЦР-планшета, как указано в протоколе прибора производителя, медленно и осторожно отсасывайте каплю, чтобы свести к минимуму сдвиг капель во время переноса. Сразу после переноса капель ПЦР-планшет должен быть запечатан во избежание испарения.

Установите температуру запайщика пластин на 180 градусов Цельсия и время на пять секунд. Коснитесь стрелки, чтобы открыть дверцу лотка. Расположите опорный блок на лотке стороной 96 лунки вверх.

Поместите пластину 96 лунок на опорный блок и убедитесь, что все колодцы пластины выровнены с крышкой опорного блока. Пластина на 96 лунок с одним листом фольги Используйте пломбы из фольги parable, совместимые с запайщиком пластин PCR и иглами в считывателе капель. Однажды 96 луночная пластина закреплена на опорном блоке и покрыта отверждаемым плёночным уплотнением.

Коснитесь кнопки запайки. Лоток закроется, и начнется нагрев потолка. Когда термосварка будет завершена, дверь откроется автоматически.

Снимите пластину с нагревательного блока, а затем снимите нагревательный блок. Убедитесь, что все лунки в пластине герметизированы, проверив углубления внутри. Фольга хорошо видна над каждой лункой.

После герметизации пластина готова к термоциклированию. Выполняйте обычную ПЦР-амплификацию, следуя параметрам, подробно описанным в тексте протокола. После ПЦР амплификация мишени нуклеиновой кислоты в каплях завершена.

Следующим шагом является анализ каждой капли по отдельности с помощью двухцветной системы обнаружения. Как правило, прибор для считывания капель настроен на обнаружение флюорочетверов FAM и VIC reporter. Нажмите кнопку «Система промывки», чтобы подготовить считыватель капель и подготовить его к анализу D-D-D-P-C-R.

Загрузите пластину в считыватель капель и нажмите «Пуск». Когда считывание капель будет завершено, откройте дверцу и снимите держатель пластины с устройства. Убирать. Извлеките настенную пластину 96 из держателя и выбросьте ее.

Затем выполните профилирование мутаций ДНК с помощью программного обеспечения для анализа данных, как описано в тексте протокола. В этом анализе D-D-P-C-R были изучены мутации RAF V 600 E. Флуоресценция была обнаружена и обработана в двумерное отображение диаграммы рассеяния.

Для рисования соответствующих ворот использовалось специальное программное обеспечение, и подсчитывалось количество капель внутри каждого затвора. Капли, представленные синими точками над розовой линией отсечения для всех образцов, являются положительными. Для мутировавших бюстгальтеров типа RAF V 600 E Wild капли представлены зелеными точками на обоих участках.

Серые точки внизу считаются фоном флуоресценции. Затем были рассчитаны общие частоты мутантных аллелей на основе относительных процентных соотношений концентраций бра дикого типа и brav V 600 E, обнаруженных в течение одного семестра. ЧСС с индивидуальным анализом может быть выполнена в течение четырех часов после этой позы.

Другие образцы, такие как жидкостная биопсия PPT, могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как мониторинг прогрессирования рака после его развития. Этот метод проложил путь исследователям в области сопутствующей диагностики для изучения различных обнаружений мутаций в области молекулярной онкологии. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как выполнять систему препарирования тканей и цифровой капли P-C-R-S-A для конкретной точки, обнаружение мутаций ДНК.