Мониторинг эндоплазматической сети кальциевого гомеостаза Использование защитного

Общая цель следующего эксперимента заключается в мониторинге нарушения регуляции уровня кальция в эндоплазматическом ретикулуме с течением времени с использованием секретируемого репортерного белка. Это достигается путем трансгенеза целевой ткани, в частности печени, с помощью вирусного вектора. В данном примере с использованием репортера Gai luciferase circa собирается биологическая жидкость, например кровь, для измерения количества circa, высвобождаемого из ткани, после чего в образцы плазмы добавляют субстрат люциферазы и измеряют люминесценцию для определения истощения запасов кальция в ЭР.

Результаты демонстрируют нарушение регуляции кальция в ЭР, на что указывает повышение уровней cAMP в плазме. Гомеостаз кальция в ЭР может контролироваться в течение длительного времени путем повторного забора небольших объемов биологических жидкостей. Основным преимуществом данного метода перед существующими способами, такими как кальциевые красители с низким сродством или генетически кодируемые индикаторы кальция, является возможность мониторинга гомеостаза кальция в ЭР in vivo в динамике с помощью минимально инвазивной процедуры. Данный метод открывает два терапевтических направления.

Первый подход заключается в скрининге препаратов, способных поддерживать или восстанавливать гомеостаз кальция в ЭР до нормального физиологического состояния. Второй подход предполагает модификацию терапевтического белка для создания терапевтических AMPs, секреция которых происходит в ответ на истощение запасов кальция в ЭР. Данный метод может дать представление о нарушении регуляции кальция в ЭР печени.

Данный метод также может быть применен к другим системам органов, таким как головной мозг, сердце, мышцы или поджелудочная железа. После проведения анестезии крысы линии sprat dolly согласно текстовому протоколу нанесите глазную мазь и проведите щипок хвоста для проверки глубины наркоза; выбрейте область живота от уровня чуть ниже ребер до средней части живота и обработайте операционное поле трижды, поочередно используя Betadine и 70% ethanol. Затем поместите крысу в положение лежа на спине на стерильную операционную поверхность и накройте стерильными хирургическими салфетками; разведите a v gluc samp до оптимизированной пользователем концентрации.

В данном случае мы использовали 7,6 × 10⁹ вирусных геномов на мл и перемешали содержимое, переворачивая пробирку. Затем пипеткой перенесите 105 µL разбавленного AAV в стерильный контейнер и с помощью иглы 30-го калибра наберите вирус в шприц. Скальпелем отметьте место разреза для доступа к печени с целью проведения инъекции.

Сделайте горизонтальный разрез длиной примерно два-три сантиметра ниже ребер. Выполните тупую диссекцию, чтобы отделить соединительную ткань от гиподермы. Рассеките мышцы брюшной стенки, обнажив правую медиальную долю печени.

Затем поместите животное под хирургический микроскоп и отрегулируйте положение так, чтобы правая срединная доля печени находилась в поле зрения. После этого с помощью шприца введите одну треть общего объема вируса в три участка паренхимы правой срединной доли, оставив иглу в ткани на 5–10 секунд после инъекции, чтобы обеспечить введение всего объема препарата; наложите швы на разрез и брюшную мышцу, а затем с помощью ватного тампона нанесите Neosporin. Поместите крысу в камеру для восстановления до тех пор, пока она не придет в сознание и не сможет удерживать вертикальное положение, после чего верните животное в индивидуальную домашнюю клетку.

Через четыре-семь дней после инъекции. Подготовьте пробирки для сбора крови, промаркировав и предварительно взвесив их. Затем добавьте в каждую пробирку 50 µL гепарина в концентрации 1000 units/mL.

После проведения анестезии крысы согласно текстовому протоколу выполните зажим хвоста для проверки степени седации и, используя стерильные ножницы, отсеките кончик хвоста на расстоянии примерно одного-двух миллиметров от края. Поdropwise соберите более 100 µL крови в пробирку, предварительно заполненную гепарином, чтобы остановить кровотечение.

С помощью влажного ватного аппликатора нанесите порошок STIC на хвост. Протирайте ножницы спиртовой салфеткой и стерилизуйте их над пламенем (стерилизация бусиной) между сборами образцов. Храните пробирки с кровью при температуре 4 °C.

При сборе последующих образцов взвесьте пробирки для сбора и скорректируйте количество гепарина, чтобы получить соотношение крови к гепарину два к одному. Этот этап позволит нормализовать количество гепарина в каждом образце. Центрифугируйте пробирки при 2000 ×g и температуре четыре градуса Celsius в течение пяти минут.

Перенесите супернатант плазмы в новую пробирку и храните при температуре 4 °C до 72 часов или при -80 °C для длительного хранения, чтобы использовать в люциферазном анализе для введения thaa garin в качестве положительного контроля. Разведите в этаноле до конечной концентрации 2,5 mg/mL. Затем введите внутрибрюшинно в нижнюю часть живота в дозе 1 mg/kg.

Возьмите первую пробу крови через 24 часа после инъекции, как описано выше. Для измерения люминесценции подготовьте рабочий субстрат selen ezine в соответствии с текстовым протоколом и инкубируйте его при комнатной температуре в защищенном от света месте в течение 30 минут.

Тем временем разморозьте все образцы на льду и перенесите 10 µL плазмы в планшет с непрозрачными стенками с помощью планшетного ридера, способного регистрировать биолюминесценцию и оснащенного инжектором субстрата. Заполните линии субстратом. Введите 100 µL субстрата в лунку.

Встряхивайте на средней скорости в течение пяти секунд и измеряйте эмиссию света для образцов in vitro. Интегрируйте эмиссию света в течение 0,5 секунд для этапа считывания, а для образцов in vivo интегрируйте в течение пяти секунд на этапе считывания для оценки гомеостаза кальция в ЭПР. С помощью метода Gluc SAR Camp можно включить несколько контролей, таких как постоянно секретируемый репортер, в данном случае Gluc Noag.

Повышение внеклеточных уровней как GLUC SAR camp, так и Gluc noag в ответ на экспериментальные условия считалось бы неоднозначным результатом. Однако увеличение секреции gluc SAR camp при отсутствии ответа gluc noag свидетельствует о событии, зависящем от кальция в ЭР. Фармакологические модуляторы запасов кальция в ЭР могут быть использованы для подтверждения вклада кальция ЭР в высвобождение SAR camp в новых парадигмах.

Например, как показано здесь, дантролен, антагонист рецептора INE, стабилизирующий кальций в ЭР, подавляет высвобождение цАМФ SAR в ответ на thic argon. Для исследований in vitro с использованием gluc-основанного цАМФ SAR ответ, вызванный воздействием, лучше всего оценивать в динамике. При отслеживании изменений относительного ответа внутри одного планшета по сравнению с контролем не рекомендуется сравнивать необработанные значения между несколькими планшетами, так как распад субстрата может привести к изменению этих значений. Для исследований in vivo данные должны оцениваться независимо для каждого животного, при этом каждое животное служит собственным контролем до начала обработки.

Это необходимо для учета вариабельности доставки и экспрессии трансгена между животными. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как использовать технологию sircam для исследования регуляции кальция в эндоплазматическом ретикулуме на моделях заболеваний печени у грызунов. Не забывайте, что работа с вирусными векторами может быть крайне опасной, и при выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование соответствующих средств индивидуальной защиты.