Целые сетчатки Экспланты из куриных эмбрионах для обработок Электропорация и химического реагента

Общая цель данной процедуры заключается в экспериментальном выделении, манипулировании и культивировании целых ретинальных имплантатов из эмбрионов цыпленка. Это достигается путем первоначального извлечения обоих глаз из эмбриона цыпленка и их помещения в чашку Петри. На втором этапе с помощью тонких пинцетов удаляют склеральную оболочку и пигментный эпителий.

Затем весь эксплантат сетчатки подвергают электропорации плазмидной ДНК с помощью плоских кольцевых электродов. Заключительным этапом является инкубация эксплантата сетчатки в культуральной среде в 24-луночном планшете в инкубаторе.

В конечном итоге все ретинальные имплантаты фиксируют, подвергают криорезекции и анализируют с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии для визуализации нейронов сетчатки. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими подходами, такими как электрофизиологические исследования in ovo, является то, что он выполняется быстро, просто и обеспечивает воспроизводимые результаты. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области развития центральной нервной системы, например, о том, как на нейрогенез после инкубации влияют специфические химические реагенты, такие как ингибиторы ферментов, или продукты генов, воздействующие на клеточный цикл.

Поместите яйца нужного эмбрионального возраста в ламинарный шкаф и протрите скорлупу 70% ethanol, чтобы избежать контаминации эмбриона. Резко ударьте яйцо сбоку о твердую поверхность, чтобы разбить его, после чего перенесите содержимое в чашку Петри диаметром 100 мм. С помощью небольшой ложки перенесите эмбрион в чашку Петри диаметром 35 мм с предварительно подогретым до 37 °C PBS, чтобы предотвратить высыхание тканей.

Затем обезглавьте эмбрион и поместите чашку Петри диаметром 35 мм с эмбриональной тканью под бинокулярный стереомикроскоп в ламинарном шкафу. С помощью тонкого пинцета сделайте надрез через ротовую полость вентральнее глаза. Начиная с места надреза, аккуратно рассеките ткани вокруг всего глаза.

Затем пережмите зрительный нерв и извлеките глаз целиком из глазницы. Возьмите и левый, и правый глаз одного и того же эмбриона для использования в качестве контрольного или опытного. Используя тонкий пинцет, перенесите глаза с помощью небольшой ложечки в новую чашку Петри диаметром 35 миллиметров с предварительно подогретым PBS.

Удалите все ткани вокруг глаза, включая склеральную оболочку. Затем сделайте небольшой надрез в пигментном эпителии в дорсальной части глаза, стараясь не повредить нейросенсорную сетчатку. После этого осторожно разорвите пигментный эпителий, начиная с места надреза.

Оставьте хрусталик и всю сетчатку прикрепленными к стекловидному телу. Удалите пигментный эпителий, соблюдая осторожность в области цилиарного тела вокруг зрачка в передней части глаза и вдоль хориоидальной щели, так как в этих местах удаление затруднено. Включите электроинструмент и установите напряжение на 15 вольт для сетчатки стадий 20–25 (hamburger и Hamilton) или на 20 вольт для сетчатки стадий 26–27.

Затем установите количество повторов импульса на пять импульсов по 50 мс, с интервалом в одну секунду между импульсами. Используйте импульсный генератор с возможностью управления ножной педалью, так как обе руки потребуются для фиксации электродов. Подключите два изготовленных на заказ платиновых электрода в форме лопаток к выходному разъему импульсного генератора.

Представленные здесь электроды были изготовлены из платиновой пластины толщиной 0,1 мм, а соединительный провод диаметром 0,8 мм был изолирован. Используя пластиковую трубку, осторожно перенесите весь эксплантат сетчатки в сосуд с помощью полиэтиленовой пастеревской пипетки с обрезанным концом. Избегайте использования наконечников для пипеток, так как сетчатка имеет тенденцию прилипать к пластику и разрываться.

Затем с помощью дозатора на 100 мкл осторожно удалите весь PBS, окружающий эксплантат сетчатки. Будьте внимательны и не касайтесь сетчатки, чтобы избежать ее разрыва. Добавьте 100 мкл разведенного раствора плазмиды к QVE и убедитесь, что весь эксплантат сетчатки покрыт раствором.

Если эксплантат сетчатки всплывает, аккуратно прижмите его пинцетом. С помощью электродов-пинцетов расположите хрусталик так, чтобы он был обращен к любой из сторон вете (vete), а зрительный нерв был направлен к дну вете. Затем поместите положительный электрод перед хрусталиком, а отрицательный электрод — за сетчаткой, не касаясь ткани.

Подайте ток, нажав на ножную педаль, и проверьте наличие пузырьков у электродов, что указывает на успешный электропороз. С помощью пипетки на 100 µL удалите всю смесь плазмид из qve, не повредив сетчатку. Смесь плазмид можно использовать повторно от трех до пяти раз после извлечения плазмиды.

Заполните vete предварительно нагретым PBS. С помощью пинцета осторожно отделите эксплантат сетчатки от стенки vete. Затем с помощью полиэтиленового пастурного дозатора перенесите весь эксплантат сетчатки в 24-луночный планшет, содержащий один миллилитр предварительно нагретой культуральной среды.

В каждую лунку помещайте только один эксплантат сетчатки. Инкубируйте эксплантат сетчатки при 37 °C и 5% CO2 на ротационном шейкере при постоянной скорости 50 RPM. Вращение обеспечивает максимальный контакт с питательной средой и предотвращает прикрепление сетчатки к дну 24-луночного планшета.

После 24 часов культивирования GFP-положительные клетки стали видны на большой части интактной сетчатки, так как электропорация привела к поглощению плазмиды и экспрессии репортерного гена на обширной области сетчатки. После секционирования одиночные GFP-положительные клетки легко обнаруживались вдоль базальной оси ACO сетчатки. Весь эксплантат сетчатки можно культивировать примерно на 24 часа дольше.

Время инкубации может привести к задержке развития, морфологическим мальформациям, апоптозу и, в конечном итоге, к дезинтеграции сетчатки. Срез целого экспланта сетчатки, культивируемого в течение 24 часов, был иммуноокрашен на phospho histone three, который отображается здесь в красном канале; phospho histone three маркирует клетки в поздней фазе G2/M. Клетки, положительные по pH three, были обнаружены на апикальной стороне сетчатки, что соответствует нормальному развитию сетчатки.

Как показано здесь, этот процесс развития может быть заблокирован путем добавления ингибитора CDK1/2; инкубация с ингибитором в течение четырех часов перед визуализацией значительно сократила количество pH3-положительных клеток в сетчатке после ее развития. Данный метод успешно применялся для исследования экспрессии генов с новых ДНК-плазмид и для обработки эксплантатов сетчатки химическими реагентами, включая регуляторы пути повреждения ДНК и клеточного цикла. После выполнения этой процедуры могут быть проведены другие методы, такие как электропорация in ovo, для дальнейшего подтверждения результатов.