Активность каспазы-3 в миндалевидного тела крыс Измеряется спектрофлюориметре после инфаркта миокарда

Инфаркт миокарда (ИМ) сопровождается не только нарушением сердечной функции, но и апоптозом миндалевидного тела, области мозга, участвующей в поведенческих последствиях ИМ. В этом протоколе описывается, как индуцировать ИМ, собрать ткань миндалевидного тела и измерить активность каспазы-3, маркера апоптоза.

Общая цель этой процедуры заключается в измерении активности каспазы-3 в миндалевидном теле крысы после инфаркта миокарда с помощью спектрофлуориметрии. Этот метод может ответить на ключевые вопросы в области поведенческой нейронауки, такие как влияние инфаркта миокарда на когнитивные функции, психическое здоровье, процесс старения и сон. Главное преимущество этой методики в том, что она проста, быстра и надежна.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что он требует ловкости для хирургического вмешательства и забора образцов тканей. Демонстрировать процедуру будет Ким Гилберт, научный сотрудник нашей лаборатории. После введения анестезии в соответствии с утвержденными институциональными протоколами подтвердите правильную анестезию через отсутствие рефлекса щипкового рефлекса лапы.

Интубируйте крысу с помощью эндотрахеальной трубки и поместите животное в положение вентрального пролежня на грелку, чтобы поддерживать температуру тела на уровне 37 градусов Цельсия. Подсоедините эндотрахеальную трубку к наркозному аппарату, дозирующему 2%-ный изофлюоран. Далее подготавливают место операции с помощью хлоргексидина глюконата и изопропилового спирта.

И нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза, чтобы предотвратить сухость. Наденьте на животное стерильную простыню, чтобы создать стерильное поле вокруг места операции. И поместите необходимые стерильные хирургические инструменты на другое стерильное поле рядом с животным.

Далее надрежьте кожу лезвием скальпеля или ножницами под номером 10. С помощью ножниц или кровоостанавливающего зажима отшелушите мышечную ткань. Затем с помощью ножниц или гемостатического зажима вскройте грудную стенку и расположите ретрактор грудной клетки, а затем откройте перикард с помощью гемостатического зажима.

Чтобы вызвать окклюзию коронарных артерий, сначала наложите шелковый шов длиной 360 мм на четыре нуля вокруг нисходящей коронарной артерии и через прилегающую ткань миокарда. Вставьте оба конца шелкового шовного материала в пластиковую трубку 14-го калибра длиной 1,25 сантиметра. Потяните за оба конца шелкового шва и прижмите трубку к артерии, чтобы закупорить ее.

Закрепите окклюзию, зажав пластиковую трубку гемостатическим зажимом, и сохраняйте окклюзию в течение 40 минут. Через 40 минут освободите окклюзию, сняв гемостатический зажим, а затем гибкую трубку и шелковый шов. Закройте грудную клетку двумя нулевыми швами и поместите гибкий катетер через грудную полость и вытяните воздух из грудной клетки с помощью шприца объемом 10 миллилитров, чтобы предотвратить пневмоторакс.

Прострочите мышцу четырьмя нулевыми шелковыми швами, а кожу - тремя нулевыми шелковыми швами. Перед тем, как закрыть последний кожный шов, снова вытяните воздух из грудной клетки с помощью шприца объемом 10 миллилитров и катетера. Закончите закрывать кожу и затем прекратите прием изофторана.

Поместите крысу в чистую клетку и наблюдайте во время восстановления после анестезии. Вводят анальгезию с повторным дозированием каждые восемь часов. После гуманного обезглавливания животного в соответствии с утвержденными процедурами, поместите голову крысы на блюдо, помещенное на колотый лед.

Используйте ножницы, чтобы открыть череп. Затем используйте ронжеры для отделения костных снопов, не повреждая подлежащие ткани путем вытягивания вверх. Затем поместите плоское лезвие шпателя между нижней частью черепа и задней вентральной поверхностью мозга и отделите мозг от черепа, осторожно толкая лезвие вперед, поднимая мозг из черепа.

Поместите мозг на его дорсальную поверхность. Определите гипоталамус перед мозжечком и разрежьте головной мозг коронально перед задним концом гипоталамуса, а также за передним концом. Определите двустороннюю миндалевидное тело как две маленькие сферы под височными долями, рядом с гипоталамусом.

Затем переверните мозг на передний конец так, чтобы тыльная поверхность была в сторону от экспериментатора. Далее отделите полушария и удалите кору из непрерывной миндалины. Когда миндалевидное тело обнаружится, отрежьте миндалевидное тело скальпелем.

Разрежьте вдоль темного шва, проходящего через миндалевидное тело, чтобы разделить базолатеральную и центральную медиальную части, а затем поместите две части в отдельные пробирки с маркировкой на лед. Этот шаг должен быть сделан как можно быстрее, чтобы предотвратить ухудшение качества ферментов. Повторив процедуру вскрытия с другим полушарием, погрузите все четыре флакона в жидкий азот на одну минуту, а затем храните в морозильной камере с отрицательным температурой 80 градусов Цельсия.

Начните с добавления 150 микролитров буфера для лизиса на каждые пять-10 миллиграммов образца льда. Обрабатывайте каждый образец ультразвуком на льду с максимальной интенсивностью в течение пяти секунд. Затем выдерживать на льду в течение 30 минут.

Во время инкубации продуцируйте образец вихрем в течение пяти секунд каждые пять минут. Затем выполните три цикла замораживания-размораживания, поместив образцы поочередно в жидкий азот и на термостатическую нагревательную пластину с температурой 37 градусов Цельсия. После окончательного цикла замораживания и оттаивания центрифугируйте образцы тканей при давлении 1300 G при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут.

Далее осторожно отсасывайте надосадочную жидкость и переложите в свежую трубку на лед. После количественного определения белка в соответствии с инструкциями в письменном протоколе добавьте 25 микрограммов белка в реакционную пробирку, содержащую 0,8 микролитра 10 миллимолярного Ac-DEVD-AMC, и реакционный буфер для получения конечного объема 200 микролитров. Для образцов с отрицательными реакциями смешайте 25 микрограммов белка с одним микролитром 800 микромолярного Ac-DEVD-CHO и 0,8 микролитра 10 мкмольярного Ac-DEVD-AMC.

Инкубируйте все образцы и контрольную группу в темноте в течение трех часов при температуре 37 градусов Цельсия. По истечении времени инкубации остановить реакцию с 600 микролитрами 0,4 молярного глицина и 0,4 молярного гидроксида натрия при pH 10 в каждом образце и контролировать. Добавьте по два миллилитра дистиллированной воды в каждую реакцию в стеклянной кювете.

Количественная оценка флуоресценции с помощью спектрофлуориметрии. Считывание элементов управления и выборок в течение 10 секунд с одним считыванием в секунду. Наконец, количественно оцените конкретную активность в каждом образце в соответствии с формулой, показанной на экране.

Эта гистограмма показывает активность каспазы-3 в миндалевидном теле крыс, перенесших инфаркт миокарда. Данные выражаются в процентном соотношении средней активности в фиктивной контрольной группе, равной 100%. Каждая группа состояла из восьми крыс. Звездочка указывает на значимую разницу между группами со значением p менее 0,05.

После освоения эта техника может быть выполнена за семь часов, не считая интервала между операцией по инфаркту миокарда и забором образцов тканей. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как вызвать инфаркт миокарда у крысы и измерить активность каспазы-3 в миндалевидном теле крысы с помощью спектрофлуориметрии.