Активность каспазы-3 в миндалевидного тела крыс Измеряется спектрофлюориметре после инфаркта миокарда

Общая цель данной процедуры заключается в измерении активности каспазы-3 в миндалевидном теле крысы после инфаркта миокарда с помощью спектрофлуориметрии. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области поведенческой нейробиологии, такие как влияние инфаркта миокарда на когнитивные функции, психическое здоровье, процессы старения и сон. Основным преимуществом данной методики является ее простота, быстрота и надежность.

Как правило, новичкам в этом методе может быть сложно, так как процедура требует хирургической точности и навыков забора тканей. Демонстрировать процедуру будет Ким Гилберт, лаборант-исследователь нашей лаборатории. После введения анестезии в соответствии с утвержденными протоколами учреждения убедитесь в достаточности наркоза по отсутствию рефлекса на сжатие лапы.

Выполните интубацию крысы с помощью эндотрахеальной трубки и поместите животное в положение на животе на грелку для поддержания температуры тела на уровне 37 °C. Подключите эндотрахеальную трубку к аппарату для наркоза, подающему 2% изофлурана. Затем обработайте операционное поле глюконатом хлоргексидина и изопропиловым спиртом.

Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза для предотвращения пересыхания. Накройте животное стерильной салфеткой, чтобы создать стерильную зону вокруг места хирургического вмешательства. Разместите необходимые стерильные хирургические инструменты на отдельном стерильном поле рядом с животным.

Затем сделайте разрез кожи скальпелем с лезвием № 10 или ножницами. С помощью ножниц или гемостатического зажима отделите мышечную ткань. После этого используйте ножницы или гемостатический зажим, чтобы открыть грудную стенку, установите ретрактор для грудной клетки и откройте перикард с помощью гемостатического зажима.

Для индукции окклюзии коронарной артерии сначала наложите петлю из шелковой нити 4-0 длиной 360 мм вокруг нисходящей коронарной артерии и через прилежащую ткань миокарда. Вставьте оба конца шелковой нити в пластиковую трубку диаметром 14 G и длиной 1,25 см. Потяните за оба конца шелковой нити и прижмите трубку к артерии для ее окклюзии.

Зафиксируйте окклюзию, зажав пластиковую трубку гемостатическим зажимом, и поддерживайте окклюзию в течение 40 минут. Через 40 минут снимите окклюзию, удалив гемостатический зажим, затем гибкую трубку и шелковую нить. Ушейте грудную клетку швом размера 2-0, введите гибкий катетер в грудную полость и удалите воздух из грудной клетки с помощью шприца объемом 10 мл для предотвращения пневмоторакса.

Зашейте мышцу шелковой нитью 4-0, а кожу — шелковой нитью 3-0. Перед наложением последнего кожного шва снова удалите воздух из грудной клетки с помощью шприца объемом 10 мл и катетера. Завершите ушивание кожи, после чего прекратите подачу изофлурана.

Поместите крысу в чистую клетку и наблюдайте за ней в период восстановления после наркоза. Введите анальгетик, повторяя дозирование каждые восемь часов. После гуманного обезглавливания животного в соответствии с утвержденными процедурами поместите голову крысы в чашку, установленную на дробленый лед.

Используйте ножницы, чтобы вскрыть череп. Затем с помощью кусачек-ронжеров отделите костные пластины, потягивая их вверх, чтобы не повредить нижележащие ткани. Затем поместите плоское лезвие шпателя между основанием черепа и задней вентральной поверхностью мозга и отделите мозг от черепа, осторожно продвигая лезвие вперед и вынимая мозг из черепной коробки.

Положите мозг на дорсальную поверхность. Найдите гипоталамус перед мозжечком и выполните корональный разрез мозга перед задним концом гипоталамуса, а также позади его переднего конца. Определите положение билатеральной миндалевидного тела в виде двух маленьких сфер под височными долями, непосредственно рядом с гипоталамусом.

Затем положите мозг плашмя на передний конец так, чтобы дорсальная поверхность была обращена от экспериментатора. Далее разделите полушария и удалите кору с прилегающей миндалевины. После обнажения миндалевины аккуратно вырежьте ее с помощью скальпеля.

Разрежьте вдоль темного шва, проходящего через миндалевидное тело, чтобы отделить базолатеральную и центрально-медиальную части, затем поместите две части в отдельные промаркированные пробирки на льду. Этот этап необходимо выполнить как можно быстрее, чтобы предотвратить деградацию ферментов. После повторения процедуры диссекции с другим полушарием погрузите все четыре пробирки в жидкий азот на одну минуту, а затем поместите их в морозильную камеру при -80 °C.

Начните с добавления 150 µL лизирующего буфера к каждым 5–10 мг образца на льду. Сонциируйте каждый образец на льду с максимальной интенсивностью в течение пяти секунд. Затем инкубируйте на льду в течение 30 минут.

Во время инкубации перемешивайте образец на вортексе в течение пяти секунд каждые пять минут. Затем проведите три цикла замораживания-оттаивания, попеременно помещая образцы в жидкий азот и на термостатическую нагревательную плиту, установленную на 37 °C. После завершения последнего цикла замораживания-оттаивания центрифугируйте образцы ткани при 1300 Gs при температуре 4 °C в течение 10 минут.

Затем осторожно аспирируйте супернатант и перенесите его в новую пробирку на льду. После количественного определения белка в соответствии с инструкциями письменного протокола добавьте 25 µg белка в реакционную пробирку, содержащую 0.8 µL 10 mM Ac-DEVD-AMC и реакционный буфер, до достижения конечного объема 200 µL. Для образцов с отрицательной реакцией смешайте 25 µg белка с 1 µL 800 µM Ac-DEVD-CHO и 0.8 µL 10 mM Ac-DEVD-AMC.

Инкубируйте все образцы и контроли в темноте в течение трех часов при 37 °C. По истечении времени инкубации остановите реакцию, добавив в каждый образец и контроль 600 µL 0,4 M глицина и 0,4 M гидроксида натрия при pH 10. Добавьте по два миллилитра дистиллированной воды в каждую реакционную смесь в стеклянной кювете.

Количественно определите флуоресценцию методом спектрофлуориметрии. Измерьте интенсивность свечения контрольных и опытных образцов в течение 10 секунд с интервалом в одну секунду между измерениями. В завершение рассчитайте удельную активность в каждом образце согласно формуле, представленной на экране.

На этой гистограмме показана активность каспазы-3 в миндалевидном теле крыс, перенесших инфаркт миокарда. Данные представлены в виде процента от средней активности в группе ложного контроля, принятой за 100%. В каждой группе было восемь крыс. Звездочкой отмечено статистически значимое различие между группами с уровнем p менее 0,05.

После освоения данная методика может быть выполнена за семь часов, не считая интервала между операцией по индукции инфаркта миокарда и отбором проб ткани. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как индуцировать инфаркт миокарда у крысы и измерить активность caspase-3 в миндалевидном теле крысы с помощью спектрофлуориметрии.