Очистка сосудов головного мозга мыши

Общая цель процедуры заключается в очистке сосудистого компартмента мозга мыши с сохранением его структурной целостности с использованием серии низкоскоростных центрифугий и фильтров без необходимости использования специфических антител или трансгенных штаммов. Было предпринято много усилий для разработки методов, позволяющих проводить клеточные, молекулярные и фармакологические исследования гематоэнцефалического барьера. Отсутствие разделения, градиентов, колоний или высокоскоростных этапов центрифугирования делает очищение сосудов мозга с помощью этой процедуры очень простым, быстрым и недорогим.

Сосуды головного мозга останутся структурно нетронутыми, а эндот-клетки будут запечатаны меточным соединением и окружены базальными ланарными паразитами, сосудистыми мышечными клетками S-большинства и периваскулярными астромембранами. Этот протокол может помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся функции сосудистого компартмента КЭ, и позволить изучить его молекулярный состав, демонстрируя процедуру, будет постдок из команды Martin Coen S. Перед началом процедуры отрежьте нижнюю часть верхней резьбовой части фильтродержателя.

Затем с помощью скальпеля проведите кожу от шеи мыши до носа и оттяните кожу назад. Промойте череп PBS, чтобы удалить любые загрязняющие волоски, а затем вставьте ножницы в череп перед обонятельными луковицами. Откройте ножницы, чтобы разорвать череп на части и удалите мозг с помощью шпателя.

Далее рассеките сосудистое сплетение из боковых желудочков и перенесите мозг в стакан объемом 150 миллилитров, содержащий 20 миллилитров раствора В-1 на льду. Затем с помощью двух скальпелей энергично разрежьте мозг на два миллиметровых фрагмента ткани, а затем используйте автоматический пуховый гомогенизатор для гомогенизации ткани в течение 20 ударов со скоростью 400 оборотов в минуту на льду. Чтобы очистить сосуды, перелейте гомогенат в пластиковую трубку объемом 50 миллилитров и раскрутите тканевую кашицу.

В центрифуге с качающимся ротором на верхней части гранулы сосуда образуется большая белая граница, состоящая в основном из миелина. Выбросьте надосадочную жидкость на 20 миллилитров ледяного раствора B two и энергично встряхивайте трубку в течение одной минуты. После повторного центрифугирования миелин образует плотный белый слой на поверхности надосадочной жидкости.

Медленно вращайте трубку, чтобы раствор В-2 мог течь вдоль стены, когда он выливается, и выбросьте миелин вместе с надосадочной жидкостью. Затем с помощью пластиковой пипетки, завернутой в абсорбирующую бумагу, удалите остатки жидкости со стенок трубки. Стараясь не задеть сосуд с дробинкой и перевернуть трубку вверх дном на лед.

Далее резусируют, суспензируют гранулу в одном миллилитре ледяного раствора В три, с последующим добавлением еще пяти миллилитров раствора В три, следя за тем, чтобы сосуды не образовывали агрегаты. Теперь поместите нейлоновый сетчатый фильтр 20 микрон на колбу Беккера и уравновесьте фильтр 10 миллилитрами ледяного раствора B three. Налейте сосудовый препарат на фильтр и тщательно промойте сосуды еще 40 миллилитрами ледяного раствора В три.

Затем с помощью чистых щипцов немедленно переложить фильтр в стакан, содержащий 30 миллилитров свежего раствора В-три, и прикрепить сосуды от фильтра с помощью легкого встряхивания. Высыпьте содержимое стакана в пластиковую трубку объемом 50 миллилитров. Затем, после центрифугирования, повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре ледяного раствора В три перед иммуноокрашиванием.

Переложите сосуды в ПЦР-пробирки объемом 0,2 миллилитра и поместите пробирки на лед до тех пор, пока ткани не оседут на дне пробирок. Затем используйте насадки для загрузки геля, чтобы отсосать большую часть жидкости. Затем вставьте силиконизированный стеклянный капилляр 40 микрометров в наконечник пипетки P 200 и используйте капилляр для переноса сосудов на предметное стекло, когда сосуды осядут, осторожно удалите жидкость с помощью листа абсорбирующей бумаги.

Затем загрузите одну каплю монтажного материала на сосуды и наложите защитное стекло под углом 45 градусов, позволяя монтажному материалу распространяться по краю стекла до тех пор, пока защитное стекло не будет установлено. На этом изображении можно наблюдать непрерывное мечение RIN вокруг нейронных эндотелиальных клеток, подтверждающее сохранение базальной пластинки на очищенных сосудах. Компоненты эндотелиальных плотных соединений, таких как ЗО, обнаруживаются и на очищенных сосудах.

Кроме того, мечение NG 2 и актина гладкой мускулатуры указывают на удержание интактных паразитов и гладкомышечных клеток сосудов соответственно. На поверхности очищенных сосудов также обнаруживаются периваскулярные соединения астроглиальных мембранных белков 43 и аквапорин 4, что свидетельствует о дополнительном удержании мембран периваскулярных астроцитов в процессе очистки, однако на изолированных сосудах наблюдаются только диспергированные и короткие GFAP-положительные волокна, что свидетельствует о том, что тела клеток астроцитов не соочищены. Только несколько нейронных волокон остаются прикрепленными к сосудам.

Аналогичным образом, положительные клетки IBA one и oli two также не обнаруживаются, что подтверждает, что микроглия и олигодендроциты не очищаются соочисткой. Мы настоятельно рекомендуем удалять текущее сплетение перед гомогенизацией мозга, так как мы воспринимали его как возможный источник загрязнения, работать в чистом помещении и избегать загрязнения волосами и пылью. Так как антитела обладают высоким неспецифическим сродством к этим материалам.

Также важно всегда выполнять ядерное окрашивание. Удалить клетки крови из очищенных сосудов можно путем проведения внутрисердечной перфузии с ПБС перед извлечением сосуда. Мы успешно извлекаем воздух и белки из очищенных с помощью этой процедуры сосудов как из свежеприготовленных, так и из замороженных поддонов сосудов.

Мы также использовали флуоресцентные зонды и конфокальную микроскопию для изучения эндотелиальной транспортной функции сосудов ex vivo. Желаем вам удачи в ваших экспериментах.