Microperfusion Техника по расследованию Правила микрососудов проницаемость у крыс брыжейки

Общая цель следующего эксперимента заключается в обеспечении возможности повторных измерений гидравлической проводимости или водопроницаемости стенок микрососудов крысиного брыжеечника в контролируемых экспериментальных условиях. Это достигается путем канюлирования микрососуда, что позволяет задавать онкотическое и гидростатическое давление в просвете, а также точно контролировать химический состав перфузата и окружающего раствора. Затем сосуд перекрывают, и движение эритроцитов, взвешенных в перфузате и служащих маркерами потока, может быть отслежено в просвете в качестве индикаторов трансваскулярного обмена жидкости.

Затем регистрируются положение и скорость красных клеток-маркеров, движущихся либо по направлению к месту окклюзии, либо в противоположном от него направлении. Наконец, окклюзия снимается и повторяется для проведения дополнительных измерений, либо сосуд подвергается повторной канюляции, после чего измерения повторяются при измененных условиях.

В конечном итоге можно провести парные измерения гидравлической проводимости в контрольных и опытных условиях, чтобы обеспечить наиболее прямое исследование факторов, регулирующих проницаемость микрососудов. Преимуществом модифицированного метода Лэндиса для исследования регуляции капиллярной проницаемости является этап перфузии. Микроперфузия позволяет измерять проницаемость стенки микрососудов в условиях, когда состав перфузата, площадь поверхности обмена и давление в микрососудах контролируются напрямую.

Данный метод позволяет исследовать вопросы, касающиеся клеточных и молекулярных механизмов регуляции проницаемости в микрососудах, репрезентативных для интактных органов, и обеспечивает возможность сравнения с результатами, полученными на культурах эндотелиальных монослоев, которые часто используются для детального изучения молекулярных механизмов. Протокол демонстрирует Джойс Кларк, менеджер нашей лаборатории. За время работы на этой должности Джойс внесла значительный вклад в совершенствование данного протокола.

Для начала с помощью электронного вытягивателя сформируйте из нескольких чистых капиллярных трубок из боросиликатного стекла конусообразные половины; при этом длина каждого кончика должна составлять примерно один сантиметр. Используйте шлифовальный круг с пневматическим приводом и абразивную бумагу с размером зерна 0,5 мкм, смоченную в воде, а также держатель для микропипеток, установленный под углом 30 градусов к горизонтали скоса микропипеток. После промывки и сушки микропипеток в соответствии с текстовым протоколом выберите те, у которых диаметр отверстия составляет около 50 мкм, а отношение длины скоса к его ширине находится в диапазоне от 3,1 до 3,5. Также они должны иметь острозаточенный кончик, что облегчает проникновение сквозь плотные коллагеновые волокна брыжейки.

Для изготовления фиксаторов ненадолго удерживайте вытянутый стеклянный капилляр без скоса над микропламенем до образования тупого конца. Повторите процедуру, чтобы изготовить несколько фиксаторов, и храните их в безпылевом контейнере. Затем изготовьте микроокклюдеры: удерживайте вытянутую капиллярную трубку без скоса под углом над микропламенем и с помощью адаптера для трубок или сломанного микропипеточного наконечника аккуратно согните трубку примерно на расстоянии четырех миллиметров от кончика под углом около 120 градусов.

Что касается стержня, важно, чтобы его кончик не был оплавлен в пламени или сломан. После проведения анестезии крысы и расположения брыжейки и кишечника в соответствии с текстовым протоколом, поместите кювету с животным на предметный столик микроскопа так, чтобы брыжейка была видна через окуляры. Установите систему гравитационной капельной подачи раствора Рингера для млекопитающих для непрерывной перфузии.

Затем зафиксируйте брыжейку, используя марлевые салфетки, чтобы удерживать кишечник на месте, помочь сохранить влагу и отвести излишки раствора Рингера с поверхности; отрегулируйте поток и аспирируйте эффлюент для поддержания постоянного слоя жидкости. Определите целевые плоские микрососуды, которые представляют собой неразветвленные сегменты ниже по течению от конвергентного потока и на один или два разветвления дистальнее истинных капилляров. Найдите неразветвленный сосуд с интенсивным кровотоком, на стенках которого отсутствуют прилипшие лейкоциты. Расположите исследуемые микрососуды в центре поля зрения микроскопа и переместите фиксатор в положение рядом с выбранным местом канюляции.

Для заполнения микропипетки наберите раствор Perfuse 8 и промытые эритроциты в шприц, подготовленный согласно текстовому протоколу, убедившись в отсутствии пузырьков воздуха в трубке. Вставьте трубку в широкий конец микропипетки до упора в коническую область. Плавно и быстро нажмите на поршень шприца, чтобы заполнить кончик микропипетки.

Когда микропипетка заполнится, на ее кончике появится маленькая струйка или капля. Извлекая трубку, осторожно нажимайте на поршень, чтобы заполнить ствол микропипетки. Затем аккуратно постучите по стволу, чтобы удалить из него мелкие пузырьки воздуха.

Затем поместите микропипетку в держатель с боковым портом, который обеспечивает постоянное гидравлическое соединение с водяным манометром. Убедитесь, что держатель, прикрепленный к гидравлическому приводу и микроманипулятору, установлен под небольшим горизонтальным углом, чтобы край конуса микропипетки не касался кишечника или лотка. С помощью шприца или заполненной водой резиновой груши отрегулируйте гидростатическое давление, воздействующее на жидкость в микропипетке, изменяя высоту столба жидкости в манометре примерно до 40 сантиметров воды над брыжейкой.

Перед тем как расположить заполненную микропипетку под микроскопом, осторожно прижмите фиксатор к ткани рядом с микрососудами, приложив достаточное усилие для захвата ткани, затем слегка отведите фиксатор назад, растягивая ткань вдоль микрососудов таким образом, чтобы напряжение в коллагеновых волокнах брыжейки было направлено вдоль сосуда. Совместите микропипетку с сосудом и опустите ее в поле зрения, глядя в окуляры. Расположите кончик чуть выше выбранного места канюляции и опустите его на ткань так, чтобы он частично затруднял ток жидкости внутри сосуда, но не перекрывал его полностью.

С помощью гидравлического привода канюлируйте сосуд, медленно вводя наконечник пипетки в просвет сосуда, стараясь не проткнуть его насквозь. По мере вхождения микропипетки в просвет перфузат будет быстро вымывать кровь из просвета сосуда и поступать в кровоток. Снизьте давление перфузии, отрегулировав манометр, до тех пор, пока эритроциты не начнут плавно колебаться в просвете сосуда.

Это позволяет определить равновесное давление, которое соответствует гидростатическому давлению в микрососудах или PC на дистальном конце сегмента микрососудов. Для проведения микроокклюзии поддерживайте перфузию сосуда при давлении выше этого равновесного значения. Используя видео- и аудиоконтроль, поместите блокиратор над перфузируемым сосудом рядом с нижним краем поля зрения микроскопа.

Словесно зафиксируйте местоположение участка блокировки, видимое в красном канале. Участок блокировки находится на отметке 57, при этом кончик блокиратора расположен непосредственно над микрососудом. Используя точную регулировку по оси Z микроманипулятора, осторожно опускайте блокиратор до тех пор, пока поток в сосуде не будет перекрыт.

Используйте аудиозапись, чтобы зафиксировать давление на манометре. Давление составляет 50. Затем приложите окклюзию на период от 3 до 10 секунд и отпустите.

Для восстановления свободной перфузии перемещайте место блокировки вверх по сосуду по направлению к кончику пипетки с шагом от 5 до 10 микрон, выполняя не более трех-пяти окклюзий в каждой точке, чтобы предотвратить повреждение стенки сосуда в месте блокировки. Проанализируйте данные в соответствии с текстовым протоколом. Данная временная зависимость позволяет измерить изменения гидравлической проводимости или LP в микрососудах крысы, успешно канюлированных с помощью четырех перфузионных игл.

Величина LP при постоянном давлении использовалась для измерения изменений в микрососудах. Проницаемость стенки оценивали при перфузии 1% BSA в качестве контроля по сравнению с 10 молярным раствором воспалительного агента брадикинина или bk. Как показано здесь, BK вызывал кратковременное увеличение LP, которое возвращалось к контрольному уровню в течение 10–15 минут.

После восстановления базового уровня с помощью 1% BSA 10 nanomolar, проводили повторную перфузию BK вместе с one micromolar pH scene one phosphate или S one P. Результаты показывают, что S one P значительно ослаблял ответ на bk. Для некоторых планов экспериментов важно оценить как коэффициент отражения растворенного вещества для макромолекулы, так и lp.

Наилучшим образом это достигается путем измерения JV при различных значениях давления в каждом отдельном микрососуде. В данном эксперименте оценивались как LP, так и эффективное онкотическое давление 5% albumin в PERFUSE eight при отсутствии albumin в тканях, окружающих микрососуды. Значение JV/S измеряли при трех различных значениях давления и отображали на графике здесь.

LP — это наклон зависимости JV/S от давления, а точка пересечения с осью давления представляет собой эффективную разность онкотического давления через стенку сосуда. В сочетании с другими методами, такими как иммунофлуоресцентное мечение и конфокальная микроскопия или даже просвечивающая электронная микроскопия, микроперфузия обеспечивает мощный анализ состояния и функции микрососудистого эндотелия с использованием сосудов с известной проницаемостью. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить повторные измерения гидравлической проводимости или водопроницаемости микрососудов брыжейки крысы в контролируемых экспериментальных условиях.

Данный подход можно применять в доступных на данный момент моделях крыс, но меня особенно интересует возможность его использования на новых генетически модифицированных крысах, которые появятся благодаря технологии CRISPR Cas nine, и я надеюсь на такое расширение области применения.