VDJ-SEQ: Глубокий анализ последовательности перестроенных тяжелой цепи иммуноглобулина ген Reveal Клональный Evolution Узоры клеточной лимфомой

Общая цель данной процедуры заключается в характеристике клонального состава образцов лимфомы для выявления паттернов клональной эволюции при рецидиве лимфомы. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области изучения лимфом, например, о том, как рецидивирующие опухоли происходят из исходных опухолей. Основным преимуществом данного протокола является адаптация новейших технологий высокопроизводительного секвенирования, что позволяет обеспечить более детальное картирование общих признаков лимфом.

В данном протоколе будет выполнена экстракция ДНК из тонких срезов замороженных тканей, залитых в OCT-компаунд, а также из нормальных или злокачественных тканей, фиксированных в формалине и залитых в парафин. Сначала подвергните 10–30 тонких срезов перевариванию в четырех миллилитрах буфера для лизиса нуклеиновых кислот с протеиназой K и 0,625% SDS в водяной бане при температуре 37 °C в течение ночи. На следующий день добавьте один миллилитр насыщенного 5 M раствора хлорида натрия к смеси для переваривания, интенсивно встряхивайте в течение 15 секунд, затем центрифугируйте при 1 100 ×g в течение 15 минут.

При комнатной температуре перенесите супернатант в новую центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров. Добавьте два объема 100% ethanol, перемешайте, перевернув пробирку шесть-восемь раз, и центрифугируйте при 5,000 ×g в течение 60 минут при температуре четыре градуса Цельсия. Для сбора осажденной ДНК промойте осадок ДНК дважды 70% ethanol, центрифугируя при 5,000 ×g по 15 минут после каждой промывки.

Для сбора осадка растворите осадок ДНК в 100–400 µL ТЕ-буфера при комнатной температуре на шейкере в течение ночи, чтобы экстрагировать ДНК из тонких срезов формалином фиксированной парафиновой ткани. Сначала проведите депарафинизацию, инкубируя парафиновые срезы в 1 мл ксилола дважды при комнатной температуре по 10 минут каждый раз. Соберите срезы ткани, центрифугируя при 13 000 ×g в течение пяти минут при комнатной температуре.

Затем удалите остатки ксилола, дважды инкубировав срезы в одном миллилитре 100% Ethanol при комнатной температуре по 10 минут. Соберите срезы ткани, центрифугировав их при 13 000 ×g в течение пяти минут. Высушите срезы на воздухе при комнатной температуре в течение 10–15 минут.

Добавьте свежеприготовленный раствор протеазы к образцам до конечного объема 50–100 µL и инкубируйте в течение ночи при 37 °C. На следующий день нагрейте образцы при 95 °C в течение 10 минут для инактивации протеиназы К. Выход ДНК после экстракций, продемонстрированных в предыдущем сегменте, составляет от 5 до 200 µg в зависимости от размера ткани.

Следующим шагом является оценка качества каждого образца ДНК в смеси в ПЦР-пробирке. Добавьте 25 мкл TDNA-полимеразы и 45 мкл мастер-микса из коммерческого набора маркеров длин. Добавьте 5 мкл ДНК в ПЦР-пробирку и тщательно перемешайте, произведя дозирование пипеткой вверх-вниз не менее пяти раз.

Проведите амплификацию ДНК в соответствии с условиями, подробно описанными в тексте протокола. Затем смешайте 20 µL смеси ПЦР с 4 µL 6x красителя для загрузки и нанесите пробу на 2% агарозный гель. По завершении электрофореза окрасьте агарозный гель бромистым этидием и определите ПЦР-продукты.

С помощью системы визуализации гелей образцы, дающие пять продуктов ПЦР размером 100, 200, 300, 400 и 600 пар оснований, будут использованы только для получения VDJ-ампликонов. В данном видео будет продемонстрирована амплификация рекомбинированного сегмента I-G-H-V-D-J из области фреймворка 1 или IGV HFR 1. Амплификация рекомбинированного сегмента I-G-H-B-D-J из области фреймворка 2 проводится по аналогичной процедуре и описана в тексте протокола в разделе «смесь в ПЦР-пробирке».

Добавьте 45 мкл мастер-микса из пробирки с надписью «mix two» из коммерческого набора для гель-детекции соматических гипермутаций IGH, 0,25 мкл Taq DNA-полимеразы и 5 мкл образец ДНК. Амплифицируйте ДНК в соответствии с условиями, описанными в тексте протокола. Для амплификации субоптимальной ДНК условия ПЦР можно скорректировать, увеличив время отжига или количество циклов амплификации. Разделите все ПЦР-продукты методом электрофореза в 2% агарозном геле. Окрасьте агарозный гель раствором бромистого этидия с концентрацией 0,5 мкг/мл и детектируйте ПЦР-продукты.

При использовании системы визуализации гелей ожидается получение моноклонального ампликона с диапазоном размеров от 310 до 380 пар оснований. Вырежьте из геля участок, содержащий моноклональный ампликон. Затем очистите ДНК из вырезанного фрагмента геля, используя стандартный набор для экстракции из геля в соответствии с протоколом производителя.

Для начала этой процедуры перенесите очищенный продукт V-D-J-P-C-R в ПЦР-пробирку и добавьте буфер для ресуспендирования Resus из набора для подготовки образцов ДНК, чтобы довести объем до 60 µL. Добавьте 40 µL смеси для репарации концов из набора для подготовки образцов ДНК, тщательно перемешайте и инкубируйте реакцию при 30 °C в течение 30 минут в предварительно разогретом термоциклере с подогревом крышки до 100 °C. Затем смешайте 136 µL магнитных частиц и 24 µL воды для ПЦР в пробирке объемом 1,5 мл, перенесите весь объем реакции репарации концов в эту пробирку и тщательно перемешайте с раствором частиц.

Поместите пробирки на магнитный штатив на две минуты, чтобы обеспечить отделение гранул от раствора. Аспирируйте супернатант и дважды промойте гранулы свежеприготовленным 80% ethanol. Полностью аспирируйте раствор этанола и дайте гранулам высохнуть на воздухе в течение 15 минут при комнатной температуре.

Через 15 минут снимите пробирки с магнитного штатива и ресуспендируйте гранулы в 17,5 µL буфера для ресуспендирования (Resus Suspension Buffer). Снова поместите пробирки на магнитный штатив на две минуты, чтобы отделить гранулы от буфера Resus Suspension Buffer. Перенесите буфер Resus Suspension Buffer, содержащий продукт восстановления концов, в чистую ПЦР-пробирку.

Следующим шагом является добавление А-хвоста к продукту восстановления концов. Добавьте 12,5 µL смеси для А-хвоста в ПЦР-пробирку с продуктом восстановления концов и тщательно перемешайте. Инкубируйте ПЦР-пробирки при 37 °C в течение 30 минут в предварительно нагретом термоциклере с подогревом крышки до 100 °C.

Для лигирования адаптеров добавьте 2,5 µL буфера для ресуспендирования Resus, 2,5 µL смеси для лигирования и 2,5 µL индексированного ДНК-адаптера в смесь для реакции достройки концов (tailing reaction). Инкубируйте реакционную смесь при 30 °C в течение 30 минут в предварительно нагретом термоциклере с подогревом крышки до 100 °C. Через 30 минут добавьте по 5 µL буфера для остановки лигирования в каждую реакцию и тщательно перемешайте.

Добавьте по 42,5 µL хорошо перемешанных магнитных частиц в каждую реакцию и промойте 80% этанолом, как было показано ранее. Добавьте 50 µL буфера Resus suspension для элюции продукта лигирования адаптеров. Повторно очистите продукт лигирования адаптеров, используя 50 µL хорошо перемешанных частиц ampu XP, и элюируйте продукт в 25 µL буфера Resus Suspension Buffer в чистую ПЦР-пробирку.

Для амплификации VDJ-ампликона добавьте 5 µL коктейля праймеров для ПЦР и 25 µL мастер-микса для ПЦР в ПЦР-пробирку, содержащую продукт лигирования адаптеров, и тщательно перемешайте; проведите амплификацию в термоциклере в соответствии с условиями, описанными в тексте протокола. По завершении амплификации очистите реакционную смесь, используя 50 µL предварительно перемешанных магнитных частиц, и элюируйте конечный продукт в 30 µL буфера Resus. Затем библиотека VTJ-ампликонов проходит валидацию, объединение в пул и секвенирование, как описано в тексте протокола.

Поскольку сложность библиотеки секвенирования VVG низка, мы рекомендуем добавлять от 20 до 50% спецификаторов (spiking) в одобренные образцы для секвенирования, чтобы обеспечить точное определение оснований. На представленных изображениях гелей показаны продукты амплификации V-D-J-P-C-R из ДНК, экстрагированной из образцов пациентов с лимфомой. Качество ампликона V-D-J-P-C-R до и после построения библиотеки оценивали с помощью биоанализатора.

Сдвиг размера с 334 пар оснований до 459 пар оснований указывает на присоединение адаптера для отслеживания клональной эволюции в случае рецидива диффузной B-клеточной крупноклеточной лимфомы. Был проведен филогенетический анализ профилей соматических гипермутаций (SHM) основных VDJ-перестроек тяжелых цепей между образцами, взятыми при постановке диагноза и при рецидиве.

Был наблюдаться вариант поздней дивергентной клональной эволюции. Были разработаны новые графические методы визуализации клональной эволюции. Представленные закономерности отображены на графиках многомерного масштабирования для моделей позднего и раннего дивергентного рецидива.

Радиус каждого круга указывает на количество субклонов, соответствующих определенному профилю SHM. Синий цвет соответствует диагностическому образцу, красный — образцу при рецидиве. Аналогичным образом, ненаправленные графы показывают, что распределение количества субклонов в случае поздней дивергенции отличается от случая ранней дивергенции.

Ребра соответствуют двум профилям SHM с расстоянием между строками в одну букву, а цветовая шкала указывает на долю последовательностей, относящихся к конкретному профилю SHM, который соответствует красному образцу при диагностике или желтому образцу при рецидиве. При выполнении данной процедуры важно избегать перекрестного загрязнения образцов. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как оценивать клональность образцов опухолей лимфомы.

Этот подход также может быть использован для отслеживания минимальной остаточной болезни и изучения иммунного надзора при раке. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.