Использование изолированными митохондриями из минимальных количествах мыши скелетных мышц для Высокая пропускная MICROPLATE респираторных измерений

Общая цель следующего эксперимента заключается в использовании технологии измерения потребления кислорода на микропланшетах для оценки функции электрон-транспортной цепи, цикла ТКК, пути бета-окисления и транспортеров субстратов. Для этого сначала подготавливают субстрат и инъекционные растворы для анализа. На втором этапе инъекционные растворы добавляют в предварительно гидратированный картридж для анализа tric, чтобы откалибровать прибор для измерения потребления кислорода.

Затем приготовьте растворы субстратов для митохондрий и внесите эти растворы в планшет для культивирования клеток. Центрифугируйте планшет для культивирования клеток, чтобы обеспечить адгезию митохондрий к лункам планшета перед его установкой в прибор для респирометрического анализа. В результате анализа будут получены данные о скорости потребления кислорода на основе дыхания митохондрий для каждого респирометрического теста.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими, такими как электрод Кларка, является то, что технологии на основе микропланшетов позволяют более эффективно и с большей пропускной способностью измерять потребление кислорода при использовании меньшего количества митохондрий; как правило, специалисты, впервые применяющие этот метод, могут столкнуться с трудностями из-за большого количества этапов подготовки растворов для анализа. Накануне эксперимента гидратируйте картридж для анализа tric в 1 mL калибровочного раствора в инкубаторе без CO2 при 37 °C. На следующий день извлеките все замороженные образцы и разморозьте их в термостате или инкубаторе при 37 °C. Приготовьте все растворы субстратов и растворы для инъекций, храните их на льду. Следующим шагом является программирование прибора для измерения потребления кислорода в многолуночных планшетах с установкой соответствующих параметров перемешивания, веса и измерения.

Запустите программное обеспечение для анализа и выберите стандартный режим. Перейдите в гостевой форум Seahorse и нажмите на мастер анализа (assay wizard). В мастере анализа перейдите в раздел «Протокол» (protocol), чтобы изменить вес смеси и параметры измерения.

Пометьте контрольные лунки на вкладке «back correction» (фоновая коррекция) и обязательно выделите их. Выполните фоновую коррекцию. Обозначьте условия, сначала перейдя на вкладку «groups and labels» (группы и метки), а затем на вкладку «group info» (информация о группе).

После ввода этих параметров нажмите кнопку «end», а затем «save template». Для начала процедуры загрузите инъекционные растворы в картридж для проведения анализа. Следите за тем, чтобы вводить растворы в соответствующие порты.

Установите картридж для анализа в прибор так, чтобы выемка в углу находилась в нижнем левом углу. Начните калибровку, сначала запустив программное обеспечение для анализа, а затем перейдя в стандартный режим. Войдите в гостевой форум Seahorse.

Откройте сохраненный шаблон на диске XF Drive во вкладке шаблонов. После открытия нажмите кнопку «start», чтобы начать калибровку, которая займет около 30 минут. Митохондрии для данной процедуры были выделены из красных скелетных мышц; осторожно, но тщательно перемешайте стоковый раствор субстрата для митохондрий, аккуратно перемещая раствор наконечником пипетки на 200 µL, у которого срезано примерно три миллиметра кончика.

После определения концентрации белка в стоковом растворе митохондрий, ресуспендируйте 10 мкг митохондриального белка в 200 мкл смеси субстратов сукцината. Осторожно, но тщательно перемешайте раствор митохондрий с субстратом, аккуратно перемешивая содержимое наконечником пипетки на 200 мкл, у которого конец обрезан примерно на три миллиметра таким же образом. Повторите процедуру, используя 14 мкг митохондриального белка на 200 мкл для каждой из остальных смесей субстратов. Поместите все смеси митохондриального белка с субстратами на лед.

Поместите 24-луночный планшет для культивирования клеток на лед и в трех повторах внесите по 50 µL в каждую лунку соответствующих смесей субстратов для митохондрий. Разработчики метода определения TRIC на базе микропланчин рекомендуют оставить минимум две контрольные лунки без митохондрий, желательно по краям планшета. Центрифугируйте планшет при 2000 ×g в течение 20 минут при температуре 4 °C для прикрепления митохондрий к поверхности лунок в процессе вращения.

Подогрейте растворы субстрата на водяной бане при 37 °C. После завершения центрифугирования осторожно внесите по 450 µL каждого раствора субстрата в соответствующие лунки. Убедитесь, что загрузка планшета проводится при комнатной температуре.

Заполните холостые лунки 500 µL холостого субстрата. В лунки, предназначенные для анализа электронного тока, следует добавить субстрат для анализа электронного тока, а в холостые лунки для сопряженного анализа можно добавить любой субстрат для сопряженного анализа. После добавления 450 µL субстрата в каждую лунку осмотрите слой митохондрий при 20-кратном увеличении, чтобы убедиться, что митохондрии равномерно распределены в виде одного монослоя.

Как показано в данном примере, лунки с изображениями, в которых монослой кажется распределенным неравномерно, могут быть удалены после этапа oc. После подтверждения адгезии митохондрий перенесите планшет с клеточной культурой в прибор для анализа Respir metric. Нажмите «ОК».

Прибор извлечет вспомогательный планшет, который использовался ранее для калибровки. Извлеките вспомогательный планшет и поместите на лоток планшет для культивирования клеток, содержащий митохондрии. Синяя выемка на планшете для культивирования клеток должна быть расположена в левом нижнем углу лотка.

Нажмите «continue» (продолжить), чтобы начать выполнение анализа, которое занимает около 40 минут. После завершения анализа нажмите «eject» (извлечь) на экране, чтобы извлечь планшет с культурой клеток. После извлечения планшета снимите и утилизируйте планшет с культурой клеток и картридж.

Нажмите «Continue» на экране. Результаты анализа будут автоматически сохранены в виде XLS-файла в папке с данными. Откройте этот файл и измените отображение с O2 на OCR, нажав на стрелку вниз под маркером Y1.

Затем в разделе «Отображение данных о скорости» (rate data displayed) выберите вариант «скорость из точки в точку» (point to point rates) вместо «средней точки» (middle point). Нажмите «ОК». Чтобы применить эти изменения, перейдите на вкладку «Режим группировки лунок» (well group mode) в левом нижнем углу экрана, чтобы объединить лунки с одинаковыми условиями в группы.

Наконец, нажмите вкладку «средняя стандартная ошибка образца» (sample mean standard error) в левой части экрана по центру. Эти команды также можно было настроить до начала анализа. Данные графики представляют скорость потребления кислорода (OCR) в зависимости от времени для четырех анализов на сопряжение.

Первая панель представляет состояние 2 — дыхание или дыхание в отсутствие DP. Вторая панель после введения DP представляет максимальное сопряженное дыхание, которое также называют дыханием в состоянии 3. Третья панель после введения олигомицина А представляет дыхание, обусловленное утечкой протонов, также называемое дыханием в состоянии 4о.

Четвертая панель после введения FCCP представляет собой максимальное разобщенное дыхание, которое также называют дыханием в состоянии 3U. Пятая панель после введения антимицина А представляет собой ингибирование окислительного дыхания. Все митохондриальные состояния имеют минимальное стандартное отклонение благодаря тщательному перемешиванию исходного раствора митохондрий и смесей субстратов для митохондрий, а также достижению однородного монослоя митохондрий после центрифугирования для адгезии.

Напротив, загрузка неодинакового количества митохондрий в каждую лунку и отсутствие единого монослоя митохондрий приводят к увеличению стандартного отклонения в каждом состоянии, что видно по синей кривой, где значения OCR превышают 1, 500 ole в минуту, а также к снижению скорости дыхания в течение периода измерения, что иллюстрируется падением значений скорости между отдельными точками. Заметьте, что красная кривая демонстрирует стабильные показатели скорости между точками, а максимальные значения OCR составляют менее 1, 500 ole в минуту. Перегрузка митохондриальным белком также может привести к истощению запаса кислорода в микрокамере лунки, что препятствует точному измерению OCR при каждом последующем замере, о чем свидетельствует синяя кривая, на которой значения O2 приближаются к нулю в течение периода измерения, а также значительно снижаются начальные значения O2 после каждого последующего измерения.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости терпения при смешивании митохондрий и растворов субстратов. После освоения этих методов можно провести дополнительные эксперименты, чтобы ответить на другие вопросы, например, как таргетная лекарственная терапия определенного транспортера субстрата влияет на потребление кислорода митохондриями?