Использование изолированными митохондриями из минимальных количествах мыши скелетных мышц для Высокая пропускная MICROPLATE респираторных измерений
30 октября 2015 г.
Представленные методы предоставляют пошаговые инструкции по выполнению коллекции респирометрических анализов на основе микропланшетов с использованием изолированных митохондрий из минимального количества скелетных мышц мыши. Эти анализы позволяют измерить механистические изменения/адаптации в потреблении кислорода в митохондриях в обычно используемой животной модели.
Общая цель данного эксперимента заключается в использовании технологии потребления кислорода на основе микропланшетов для оценки функции цепи переноса электронов, пути бета-окисления цикла ТСА и транспортеров субстрата. Это достигается путем предварительной подготовки субстрата и инъекционных растворов для проведения анализа. Второй шаг заключается в добавлении растворов для инъекций в предварительно гидратированный картридж для трикционного анализа для калибровки аппарата для потребления кислорода.
Затем приготовьте растворы митохондриального субстрата и загрузите эти растворы в планшет для культивирования клеток. Вращайте планшет для клеточной культуры, чтобы обеспечить прилегание митохондрий к планшету задолго до загрузки планшета в метрический анализ Respira. Получены инструментальные результаты, которые показывают скорость потребления кислорода на основе митохондриального дыхания для каждого респирометрического анализа.
Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как электрод Кларка, заключается в том, что технологии на основе микропланшетов позволяют более эффективно и с большей пропускной способностью получать потребление кислорода при меньшем количестве митохондрий, как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности из-за всех движущихся частей, участвующих в приготовлении растворов для анализа В ночь перед экспериментом картридж для гидратного анализа в одном миллилитре калибровочного раствора в не. В инкубаторе с СО2 при температуре 37 градусов Цельсия на следующий день выньте все замороженные стебли и разморозьте их в ванне или инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия. Приготовьте все растворы субстрата и растворы для инъекций и храните их на льду. Следующим шагом является программирование многолуночной машины для измерения потребления кислорода на соответствующий вес смеси и измеряемые параметры.
Войдите в программное обеспечение для анализа и выберите стандартный режим. Зайдите на гостевой форум морских коньков и нажмите на мастера анализа. Оказавшись в мастере анализа, нажмите на «Протокол», чтобы изменить вес смеси и параметры измерения.
Обозначьте фоновые лунки под вкладкой коррекции спины и обязательно выделите. Сделайте коррекцию фона. Пометьте условия, сначала щелкнув вкладку групп и меток, а затем вкладку информации о группе.
После ввода этих параметров нажмите кнопку «Конец», а затем «Сохранить шаблон». Чтобы начать эту процедуру, загрузите растворы для инъекций в картридж для анализа. Следите за тем, чтобы вводить растворы в соответствующие порты.
Загрузите картридж для пробирного теста в машину с зазубренным углом в левом нижнем углу. Начните калибровку, сначала войдя в программное обеспечение для анализа, а затем перейдя в стандартный режим. Зайдите на гостевой форум морских коньков.
Откройте сохраненный шаблон в XF Drive на вкладке шаблонов. После открытия нажмите «Пуск», чтобы начать калибровку, которая займет около 30 минут. Митохондрии для этой процедуры были выделены из красных скелетных мышц, осторожно, но тщательно перемешали субстрат митохондрий, осторожно перемешивая раствор с помощью наконечника пипетки объемом 200 микролитров, у которого было отрезано около трех миллиметров конца.
После определения концентрации белка в митохондриальном запасе, ресуспендируют 10 мкг митохондриального белка на 200 мкг сукцинатной гнили известной субстратной смеси. Осторожно, но тщательно перемешайте раствор митохондриального субстрата, осторожно помешивая, и смешайте раствор с помощью наконечника пипетки объемом 200 микролитров, конец которого был отрезан примерно на три миллиметра таким же образом. Полоса Риза, 14 микрограммов митохондриального белка на 200 микролитров каждой из оставшихся смесей субстрата помещают все смеси митохондриальных белковых субстратов на лед.
Поместите 24-луночный планшет для клеточной культуры на лед и в тройном порядке загрузите по 50 микролитров на лунку каждой из смесей субстрата митохондрий. Разработчики TRIC-анализа на основе микропланшетов рекомендуют оставлять как минимум две пустые лунки без митохондрий, предпочтительно по обе стороны от планшета для клеточной культуры. Вращайте планшет для клеточной культуры при температуре 2000 G в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы приклеить митохондрии к лункам во время вращения пластины.
Прогрейте растворы основания на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. После завершения отжима осторожно загрузите 450 микролитров каждого раствора субстрата в соответствующие лунки. Обязательно загружайте пластину при комнатной температуре.
Загрузите в глухие лунки 500 микролитров заготовки субстрата. Лунки, предназначенные для анализа потока электронов, должны быть загружены подложкой для электронного потока, в то время как проложенные лунки для связанного анализа могут быть загружены любой подложкой для связывающего анализа. После того, как в каждый из них будет добавлено 450 микролитров субстрата, хорошо рассмотрите слой митохондрий в лунке при 20-кратном увеличении, чтобы убедиться, что митохондрии равномерно распределены в одном монослое.
Как показано в этом примере, ячейки изображения, которые не кажутся равномерно распределенными монослоями, могут быть удалены после oc. После подтверждения адгезии митохондрий поднесите планшет для культивирования клеток к прибору для метрического анализа Rebreath. Нажмите OK.
Машина извлечет рабочую пластину, которая использовалась ранее для калибровки. Снимите рабочую пластину и поместите на лоток планшет для клеточных культур, содержащий митохондрии. Синяя выемка на планшете для клеточных культур должна быть размещена в левом нижнем углу лотка.
Нажмите «Продолжить», чтобы начать прогон анализа, который занимает около 40 минут. После завершения прогона нажмите кнопку «Извлечь» на экране, чтобы извлечь планшет для культивирования клеток. После извлечения планшета извлеките и выбросьте планшет для клеточной культуры и картридж.
Нажмите «Продолжить» на экране. Прогон будет автоматически сохранен в файле данных в формате XLS. Откройте этот файл и измените отображение с O2 на OCR, нажав стрелку вниз под маркером Y one.
Затем измените среднюю точку на точку в точке под данными о курсах, отображаемыми в качестве опции. Нажмите OK. Чтобы применить эти изменения, щелкните вкладку режима группировки скважин в левом нижнем углу экрана, чтобы сгруппировать скважины с похожими условиями.
Наконец, щелкните вкладку «Пример средней стандартной ошибки» в центре экрана слева. Эти команды также могут быть настроены перед анализом. Эти трассировки представляют собой скорость потребления кислорода или OCR в зависимости от времени для четырех анализов сопряжения.
Первая панель представляет второе состояние, дыхание или дыхание в отсутствие DP. Вторая панель после введения A DP представляет собой максимальное сопряженное дыхание, также называемое дыханием третьего состояния. Третья панель после введения олиго мицина. A представляет собой дыхание из-за утечки протона, также называемое четвертым состоянием дыхания.
Четвертая панель после инъекции FCCP представляет собой максимальное несвязанное дыхание, также называемое дыханием третьего состояния. Пятая панель после введения антимицина А представляет собой ингибирование окислительного дыхания. Все митохондриальные состояния имеют минимальное стандартное отклонение из-за тщательного перемешивания митохондриального запаса и митохондриального субстрата и получения одного монослоя митохондрий после адгезии.
Напротив, неравномерная нагрузка митохондрий в каждой лунке и отсутствие единого монослоя митохондрий приводит к увеличению стандартного отклонения в каждом состоянии, на что указывает синяя кривая, которая показывает значения OCR выше 1500 мкл в минуту, а также к снижению скорости дыхания в течение периода измерения, примером чего является снижение значений скорости от точки к точке. Обратите внимание, что красная кривая показывает постоянную скорость от точки к точке, а максимальные значения OCR составляют менее 1 500 оле в минуту. Перегрузка митохондриальных белков также может привести к истощению кислорода в микрокамере скважины, что препятствует точному измерению OCR при каждом последующем измерении, на что указывает синяя трасса, которая показывает, что значения O2 приближаются к нулю в течение периода измерения, а также значительно снижаются начальные значения O2 после каждого последующего измерения.
Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о пациенте при смешивании растворов митохондрий и субстрата. Как только эти методы будут освоены, можно будет провести дополнительные эксперименты, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, как лекарственное таргетное лечение определенного транспортера субстрата влияет на потребление кислорода митохондриями?
Обзор
В данной статье представлены методы проведения микропланшетных респиратометрических анализов с использованием изолированных митохондрий из скелетной мускулатуры мыши. Эти анализы позволяют измерять изменения в потреблении кислорода митохондриями, предоставляя важные сведения о метаболических адаптациях.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Метаболическая физиология
Фон
- Микропланшетные технологии повышают эффективность измерений потребления кислорода.
- Изолированные митохондрии из скелетной мускулатуры служат моделью для изучения функции митохондрий.
- Понимание митохондриального дыхания имеет важное значение для получения представления о метаболических заболеваниях.
- Традиционные методы, такие как электрод Кларка, менее эффективны для высокопроизводительного анализа.
Цель исследования
- Оценить функцию цепочки переноса электронов и цикла ТКА.
- Оценить митохондриальные адаптации в ответ на различные субстраты.
- Предоставить детальный протокол для исследователей, новых в этом методе.
Использованные методы
- Подготовка субстрата и растворов для инъекции в анализ.
- Калибровка машины для измерения потребления кислорода с использованием гидратированного картриджа анализа.
- Изоляция и подготовка митохондрий из скелетной мускулатуры мыши.
- Проведение респиратометрических анализов для измерения скорости потребления кислорода.
Основные результаты
- Успешное измерение скорости митохондриального дыхания с использованием микропланшетной технологии.
- Демонстрация более высоких возможностей по пропускной способности по сравнению с традиционными методами.
- Определение оптимальных условий для адгезии митохондрий и загрузки субстрата.
Выводы
- Микропланшетные респиратометрические анализы эффективны для изучения функции митохондрий.
- Этот метод позволяет эффективно использовать ограниченные митохондриальные образцы.
- Детальные протоколы могут помочь исследователям внедрить эти анализы в своих исследованиях.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
This method enables high-throughput assessment of mitochondrial function using minimal skeletal muscle tissue, supporting early-stage target validation in metabolic disease research. By providing quantitative oxygen consumption data from isolated mitochondria, it enhances predictive confidence in pathway modulation studies. The approach addresses a key gap in scalable mitochondrial phenotyping for preclinical de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables mechanistic interrogation of electron transport chain, TCA cycle, and fatty acid oxidation pathways in a disease-relevant model.
- Operational Value: Requires only microgram quantities of mitochondrial protein, conserving precious preclinical samples.
- Scientific Value: Supports target hypothesis testing by linking substrate transporter modulation to respiratory output.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates reproducible, quantitative OCR measurements across multiple respiratory states for compound screening.
- Operational Value: Microplate format allows parallel testing of conditions, improving assay throughput and reagent efficiency.
- Scientific Value: Standardized mitochondrial adherence and substrate loading reduce well-to-well variability, enhancing data reliability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant skeletal muscle mitochondrial data to inform translational biomarker strategies.
- Operational Value: Enables longitudinal assessment of metabolic adaptations in preclinical models.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by isolating mitochondrial contributions to whole-tissue phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows, enabling mitochondrial phenotyping after target identification and before efficacy testing.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional validation of metabolic targets in skeletal muscle.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible OCR readouts for hit confirmation and structure-activity relationship analysis.
- Analytics: Provides state-resolved respiration metrics (basal, coupled, leak, uncoupled) to compare metabolic phenotypes across conditions.
- Translational Research: Connects in vitro mitochondrial function to preclinical continuity via disease-relevant tissue model.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized mitochondrial assay platform applicable across multiple metabolic targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target engagement by linking modulation to measurable respiratory changes.
- Operational Value: Reduces sample consumption through low-input, high-precision measurements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early metabolic liability data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on mitochondrial safety and efficacy profiles.
Implementation Considerations
- Expertise in mitochondrial isolation and respirometry is required for reliable results.
- Access to a microplate-compatible oxygen consumption analyzer and associated cartridges is necessary.
- Standardization of mitochondrial protein quantification and substrate preparation across teams ensures reproducibility.
- Adaptation to other tissues may require optimization of isolation and adherence protocols.
- Technical precision in mixing and monolayer formation is critical to minimize variability in OCR measurements.
