Выделение митохондрий из минимальных количествах мыши скелетных мышц для измерения Высокая пропускная микропланшетов дыхания

Общая цель данной видеостатьи — выделить высококачественные митохондрии из небольшого количества скелетных мышц мыши для использования в анализах на потребление кислорода (tric assays) с применением микропланшетов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы биомедицинских исследований, например, описать, как определенные препараты и белки модулируют потребление кислорода митохондриями скелетных мышц. Основным преимуществом данной методики является возможность выделения высококачественных митохондрий из меньшего количества скелетных мышц мыши, чем сообщалось ранее.

Выполните эвтаназию мыши в соответствии с рекомендациями вашего учреждения. Затем положите мышь на бок и с помощью остроконечных ножниц сделайте разрез кожи над латеральным надмыщелком бедренной кости.

Оттяните кожу в сторону мыши, затем удалите жировую подушку, расположенную над точкой прикрепления четырехглавой мышцы бедра. Затем перережьте сухожилие четырехглавой мышцы, прикрепленное к надколеннику. Осторожно перережьте апоневроз между костью и четырехглавой мышцей, стараясь не повредить бедренную артерию.

Затем перережьте сухожилие в точке прикрепления к бедренной кости, чтобы высвободить четырехглавую мышцу, и поместите мышцу в охлажденный PBS. С помощью ножниц удалите всю видимую жировую ткань с четырехглавой мышцы. После очистки переверните мышцу так, чтобы часть, прилегавшая к бедренной кости, была обращена вверх.

С помощью пинцета раскройте четырехглавую мышцу веерообразными движениями. Извлеките два видимых участка красной мышечной ткани из каждой доли и поместите их в стакан, содержащий 5 mL охлажденного буфера для выделения митохондрий.

Затем сделайте разрез кожи над ахилловым сухожилием с помощью остроконечных ножниц и отслоите кожу в сторону головы мыши. Перережьте обнажившееся ахиллово сухожилие и отслоите мышцу в сторону тела мыши. Перережьте сухожилие у латерального и медиального мыщелков бедренной кости, чтобы освободить икроножную мышцу, и поместите ее вместе с прикрепленными сухожилиями в чашку с охлажденным PBS.

Переверните икроножную мышцу и отделите камбаловидную мышцу. Поместите камбаловидную мышцу в стакан, содержащий 5 mL охлажденного буфера для изоляции митохондрий.

Затем вскрыли икроножную мышцу и извлекли три видимых участка красной мышечной ткани. Это две латеральные части и одна медиальная поверхностная красная полоса. После изоляции перенесите красную мышцу в стакан, содержащий 5 mL охлажденных митохондрий.

Буфер для изоляции один. Удалите еще 75–100 мг красной мышцы с другой ноги мыши, повторив только что описанную процедуру.

Поместите препарированную мышцу второй ноги в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл с коктейлем ингибиторов протеаз и фосфатаз, а также буфером для лизиса клеток, приготовленными согласно описанию в прилагаемом текстовом протоколе. Немедленно подвергните вторую пробу мгновенному замораживанию в жидком азоте для последующего использования в вестерн-блоттинге. Поместите предварительно нагретую плоскую пластиковую поверхность на лед в большой контейнер.

Затем капните одну каплю буфера для выделения митохондрий на пластиковую поверхность и с помощью пинцета поместите все секции красной мышцы в эту каплю буфера для выделения. Измельчайте мышечную ткань в течение двух минут, используя односторонние лезвия бритвы, заменяя лезвие на новое острое каждые 40 секунд. Перенесите измельченную ткань в новый стакан с пятью миллилитрами свежего буфера для выделения митохондрий.

Буфер для изоляции один. Затем профильтруйте раствор через клеточный сепаратор с размером пор 100 мкм, помещенный в коническую пробирку объемом 50 мл. Промокните ткань деликатной безворсовой салфеткой, а затем перенесите её в 5 мл 0,05% раствора трипсина.

С помощью пинцета удалите все остатки ткани с салфетки для очистки и добавьте их в трипсин. Инкубируйте мышечную ткань в растворе трипсина на льду в течение 30 минут. Затем центрифугируйте образец при 200 ×g в течение трех минут при температуре four °C.

После центрифугирования слейте супернатант с трипсином в контейнер для отходов и ресуспендируйте осадок в трех миллилитрах ледяного буфера для изоляции митохондрий один. Затем перенесите ткань в стеклянную гомогенизационную трубку объемом 45 миллилитров. Промойте коническую трубку объемом 15 миллилитров еще 1,5 миллилитрами буфера для изоляции митохондрий один, чтобы собрать остатки образца, и добавьте полученный раствор в стеклянную гомогенизационную трубку.

Затем поместите стеклянную трубку гомогенизатора в стакан или пластиковый контейнер, заполненный льдом наполовину, так чтобы стеклянный гомогенизатор минимально смещался внутри стакана. Гомогенизируйте образец с помощью пестика из политетрафторэтилена, закрепленного на двигателе для гомогенизации тканей.

Гомогенизируйте образец 10 раз при 80 об/мин. В конце каждого прохода удерживайте поршень в нижнем положении примерно две секунды. Затем перенесите гомогенат ткани в новую коническую пробирку объемом 15 мл.

Промойте стеклянную трубку гомогенизатора 6,5 мл буфера для выделения митохондрий №1. Перелейте буфер в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую оставшуюся часть ткани. Гомогенизируйте образец. Центрифугируйте пробу при 700 ×g в течение 10 минут при температуре 4 °C, затем осторожно перелейте супернатант в пробирку для центрифуги из высокопрочного стекла и удалите осадок.

Затем центрифугируйте супернатант при 8,000 ×g в течение 10 минут при температуре four degrees Celsius. Чтобы осадить митохондрии, снимите супернатант и ресуспендируйте осадок, медленно добавляя 500 µL буфера для выделения митохондрий 2; обрежьте кончик наконечника пипетки и осторожно гомогенизируйте осадок в буфере, используя перемешивающие и вращательные движения. Затем добавьте еще 4.5 mL буфера для выделения митохондрий.

Добавьте буфер 2 в смесь. После полного суспендирования осадка центрифугируйте гомогенат при 8 000 ×g в течение 10 минут при 4 °C, чтобы снова осадить митохондрии. Удалите супернатант и осторожно, но полностью ресуспендируйте осадок, добавляя буфер 2 для выделения митохондрий порциями по 25 µL (всего 2 порции); используя наконечник пипетки с обрезанным кончиком, аккуратно перемешивайте осадок после каждого добавления 25 µL буфера.

По завершении поместите этот сток митохондрий на лед. Приготовьте два отдельных разведения стока митохондрий 1 к 20 в воде высокой степени очистки. Добавьте 0,1% Triton 100 x в один из образцов и подвергните его воздействию ультразвука в течение 10 секунд на низкой мощности.

Оставьте другой разведенный раствор на льду, а обработанный ультразвуком образец верните на лед. После соникации проведите анализ на цитратсинтазу с использованием как не подвергавшихся, так и подвергавшихся соникации разведений митохондрий с помощью фотометрического метода по стандартным методикам; определите процент неповрежденных мембран митохондрий, используя формулы, приведенные в прилагаемом текстовом протоколе. Соникация митохондрий приводит к статистически значимому увеличению активности цитратсинтазы.

Активность цитратсинтазы в несоникатированных образцах митохондрий по сравнению с соникатированными образцами показывает, что 92,5% митохондрий остались интактными после выделения. Экспрессия ga. DH и COX four отчетливо видна в лизате всей ткани, а в выделенных митохондриях наблюдается экспрессия Cox four. В то время как полосы GA DH выражены слабо, эти результаты свидетельствуют о качественном выделении митохондрий с минимальным загрязнением немитохондриальными компонентами в процессе процедуры выделения.

При выполнении данной процедуры важно помнить, что с исходным стоком митохондрий следует обращаться осторожно: после завершения процедуры ни в коем случае не подвергайте его воздействию вортекса и не перемешивайте интенсивно. Для получения ответов на дополнительные вопросы, например, о том, влияет ли вмешательство на выработку активных форм кислорода в изолированных митохондриях, можно использовать другие методы, такие как измерение продукции активных форм кислорода.