Выделение митохондрий из минимальных количествах мыши скелетных мышц для измерения Высокая пропускная микропланшетов дыхания

Общая цель этой видеостатьи — выделить высококачественные митохондрии из небольшого количества скелетных мышц мыши для использования в трик-анализах на основе микропланшетов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы биомедицинских исследований, такие как описание того, как определенные лекарства и белки модулируют скелетные мышцы, потребление кислорода митохондриями. Основное преимущество этого метода заключается в том, что высококачественные митохондрии могут быть выделены из меньшего количества скелетных мышц мыши, чем сообщалось ранее.

Проводить эвтаназию мыши в соответствии с рекомендациями учреждения. Затем положите мышь на бок и с помощью ножниц с тонким наконечником сделайте надрез на коже. Наложение на латеральный надмыщелок бедренной кости.

Отчистите кожу по направлению к мыши, а затем удалите жировую подушку, расположенную над точкой начала четырехглавой мышцы. Далее разрежьте сухожилие четырехглавой мышцы, которое прикреплено к коленной чашечке. Медленно разрежьте апоневроз между костью и четырехглавой мышцей, избегая бедренной артерии.

Затем разрежьте сухожилие в исходной точке бедренной кости, чтобы освободить четырехглавую мышцу, и поместите четырехглавую мышцу в охлажденный PBS. Удалите видимую жировую ткань над квадрицепсами с помощью ножниц. После очистки переверните квадрицепсы так, чтобы часть мышцы, которая покрывала бедренную кость, была обращена вверх.

Раскройте четырехглавую мышцу щипцами веерными движениями. Удалите две видимые красные части мышц из каждой доли и поместите их в стакан, содержащий пять миллилитров охлажденных митохондрий. Изоляционный буфер.

Затем разрежьте кожу над ахилловым сухожилием ножницами с тонким кончиком и отклейте кожу по направлению к мыши. Разрежьте обнаженное ахиллово сухожилие и очистите мышцу по направлению к телу мыши. Разрежьте сухожилие на латеральном и медиальном мыщелках бедренной кости, чтобы освободить икроножную мышцу, и поместите икроножную мышцу, прикрепленную к ее сухожилиям, в посуду, наполненную охлажденным PBS.

Переверните икроножную мышцу и снимите камбаловидную мышцу. Поместите камбаловидную мышцу в стакан, содержащий пять миллилитров охлажденных митохондрий. Изоляционный буфер.

Один следующий вентилятор открыл желудочную мышцу и удалил три зрительные красные части мышц. Будет две боковые части и одна медиальная поверхностная красная полоса. После изоляции перенесите красную мышцу в стакан, содержащий пять миллилитров охлажденных митохондрий.

Буфер изоляции один. Удалите еще от 75 до 100 миллиграммов красной мышцы с другой ноги мыши. Повторяем только что показанный процесс.

Поместите рассеченную мышцу второй ноги в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра с коктейлем из протеазы и ингибитора фосфатазы и буфером для лизиса клеток, приготовленным, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Сразу же перешиваем, второй образец замораживаем в жидком азоте для использования в вестерн-блоттинге. Поместите предварительно зажившую плоскую пластиковую поверхность на лед в большое ведро.

Затем вылейте каплю изолирующего буфера митохондрий на пластиковую поверхность и с помощью пинцета поместите всю разделенную красную мышцу в изолированную каплю. Буфер. Измельчите мышечную ткань в течение двух минут с помощью лезвий бритвы с одним лезвием, меняйте на новую острую бритву каждые 40 секунд. Переложите измельченную ткань в новую мензурку с пятью миллилитрами свежих митохондрий.

Буфер изоляции один. Затем возьмите раствор и слейте его через сетчатое фильтр на 100 микрон, помещенное на коническую трубку объемом 50 миллилитров. Промокните ткань деликатной задачей салфеткой, а затем переведите ее в пять миллилитров 0,05%-ного раствора триина.

С помощью пинцета удалите остатки ткани с салфетки и добавьте ее к трипсину. Инкубируйте мышечную ткань в растворе трипсина на льду в течение 30 минут. Затем центрифугируйте образец при 200-кратном G в течение трех минут при четырех градусах Цельсия.

После центрифугирования вылейте трипсин супинат в контейнер для отходов и повторно суспендируйте гранулу тремя миллилитрами ледяного буфера для изоляции митохондрий. Затем переложите ткань в стеклянную трубку-гомогенизатор объемом 45 миллилитров. Промойте 15-миллилитровую коническую трубку еще 1,5 миллилитрами митохондриального буфера, чтобы собрать оставшийся образец, и добавьте его в стеклянную трубку гомогенизатора.

Затем поместите стеклянную трубку гомогенизатора в стакан или пластиковый контейнер, наполовину заполненный льдом. Таким образом, стеклянный гомогенизатор минимально перемещается внутри стакана. Гомогенизируйте образец с помощью политетрафторэтиленового пестика, прикрепленного к ткани, приводимой в движение двигателем.

Гомогенизатор с 10 при 80 об/мин. Удерживайте нижнюю часть каждого прохода около двух секунд. Затем переложите ткань гомогената в новую коническую трубку объемом 15 миллилитров

И промойте стеклянную трубку гомогенизатора с 6,5 миллилитрами изолирующего буфера митохондрий. Налейте буфер в коническую трубку объемом 15 миллилитров, содержащую остальную ткань. Гомогенизировать. Вращайте образец при 700 умноженных на G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия, а затем аккуратно вылейте супинат в высокопрочную стеклянную центрифужную пробирку и выбросьте гранулу.

Затем вращайте снат при 8 000 умноженных на G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Чтобы гранулировать митохондрии, удалите snat и повторно суспендируйте гранулу, медленно добавив 500 микролитров буфера для изоляции митохондрий, отрежьте конец наконечника пипетки и аккуратно гомогенизируйте гранулу в буфере с помощью перемешивания и перемешивания. Затем добавьте еще 4,5 миллилитра митохондриального выделения.

После того, как гранула полностью взвесится, вращайте гомогенат при температуре 8 000 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы снова гранулировать митохондрии. Удалите надосадочную жидкость S и аккуратно, но полностью ресуспендируйте гранулу, добавив 2 раза по 25 микролитров для выделения митохондрий. Буфер два, используя наконечник для пипетки с отрезанным концом, аккуратно перемешайте и перемешайте гранулу после каждого выпуска 25 микролитров буфера.

Когда закончите, положите этот митохондриальный запас на лед. Сделайте два отдельных разведения от одного до 20 разведений митохондриального запаса в воде высокой чистоты. Добавьте 0,1% Triton 100 x к одному образцу и обрабатывайте ультразвуком в течение 10 секунд при низкой настройке.

Оставьте другой раствор на льду и верните обработанный ультразвуком образец на лед. После ультразвуковой обработки выполните анализ цитратсинтазы с использованием как ультразвука, так и ультразвука митохондриального разведения с использованием фотометрического анализа с использованием стандартных методов, определите процент интактных мембран митохондрий с помощью уравнений, приведенных в сопроводительном текстовом протоколе. Синдицирование митохондрий приводит к статистически значимому увеличению активности цитратсинтазы.

Активность цитратсинтазы в образцах митохондрий, не обработанных ультразвуком, по сравнению с образцами, обработанными ультразвуком, показывает, что 92,5% митохондрий остаются интактными после выделения экспрессии ga. DH и ЦОГ 4 проявляются во всей ткани, лизат в изолированных митохондриях наблюдается экспрессия ЦОГ 4. Несмотря на то, что видны только слабые полосы GA DH, эти результаты указывают на хорошие митохондриальные выделения с небольшим загрязнением немитохондриальными компонентами во время процедуры изоляции.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о бережном обращении с митохондриальным запасом, никогда не закручивая его и не перемешивая энергично после этой процедуры. Другие методы, такие как измерение продукции активных видов кислорода, могут быть применены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, влияет ли вмешательство на производство активных форм кислорода в изолированных митохондриях.