Изучение микробных сообществ В Vivo: Модель узла опосредованного взаимодействия между Candida Albicans И Синегнойной палочки В Airways

Общая цель этой процедуры — построить модель для изучения взаимодействий между отдельной бактерией и отдельным грибком. Это сообщение может помочь ответить на ключевые вопросы в области взаимодействия патогенов, например, какие факторы участвуют в перекрестных помехах и межвидовом диалекте. Основным преимуществом данной методики является то, что данные, полученные с помощью этой модели in vivo, имеют клиническую значимость.

Чтобы интраназально установить грибок, сначала разведите два раза по десять до шестого КОЕ C.albicans на миллилитр в стерильных PBS. Далее, после подтверждения утраты выпрямляющего рефлекса у взрослой гипотонической мыши, аспирируют не менее 50 микролитров грибковой суспензии в пипетку объемом 200 микролитров. Теперь возьмитесь за мышь одной рукой и поверните животное так, чтобы оно лежало на спине животом вертикально.

Когда мышь находится на месте, используйте указательный палец руки, держащей мышь, чтобы поддерживать голову, и большой палец, чтобы держать челюсть закрытой, и переместите кончик пипетки ближе к носу животного. Затем осторожно нанесите 50 микролитров капли гриба на ноздри, позволяя самопроизвольному дыханию мыши вдыхать каплю. И поместите мышь одну в клетку до тех пор, пока она полностью не восстановится.

Через четыре дня после установки C.albicans следует побрить брюшную полость усыпленного животного с последующей стерилизацией открытым способом открытых участков кожи. Далее с помощью ножниц вскройте кожу от грудины до середины живота. Затем продлите разрез вдоль грудной клетки по обе стороны от средней линии и отогните кожу по обе стороны от грудной клетки.

Когда грудная клетка будет видна, сделайте вертикальный разрез с обеих сторон грудной клетки по направлению к ключицам и используйте грудину, чтобы откинуть всю переднюю стенку грудной клетки, чтобы визуализировать сердце и легкие. Затем с помощью предварительно гепаринизированного шприца проколют сердце рядом с внутрижелудочковой артерией, и заберут минимум 500 микролитров крови. Положите образец крови на лед.

Затем сделайте разрез шейного отдела по средней линии, чтобы открыть трахею. Тщательно рассеките фасцию вокруг трахеи с последующим наложением шва под трахею. Затем с помощью модифицированной иглы для катетеризации трахеи используйте модифицированную иглу для зондирования, закрепив канюлю ранее наложенным швом.

Чтобы провести бронхоальвеолярный лаваж, осторожно введите в легкое 500 микролитров ледяного PBS. Затем отсадите жидкость для промывания и переведите жидкость в двухмиллилитровую центрифужную пробирку на льду. Собрав еще два образца по 500 микролитров, извлеките легкие из грудной клетки, и поместите кусочек легкого в центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра для немедленного хранения при температуре минус 80 градусов Цельсия.

Затем поместите еще один кусочек легочной ткани в предварительно взвешенную гемолизную трубку, содержащую PBS на льду. Наконец, сделайте надрез в левой части живота. Соберите селезенку во вторую трубку для гемолиза, содержащую один миллилитр PBS, и поместите трубку на лед.

Модель четырехдневной персистенции получена путем интраназальной установки C.albicans в пять раз десять-пятый раз на одну мышь. В течение этих четырех дней мыши набирают вес, но не проявляют повреждения легких. Однако по мере увеличения КОЕ инокулюма увеличивается и повреждение легких.

При этом максимальное поражение легких наблюдается между 24 и 36 часами после заражения. Бактериальная нагрузка, напротив, демонстрирует снижение на один log КОЕ на миллилитр каждые 24 часа, при этом кумулятивное увеличение бактериальной диссеминации наблюдается в течение каждого дня. В бронхоальвеолярном лаваже, собранном у инфицированных мышей, нейтрофилы широко рекрутируются, при этом дифференциальное количество клеток демонстрирует 90 процентов нейтрофилов и 10 процентов макрофагальных лимфоцитов, инфильтрирующих иммунную популяцию клеток.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как анализ бронхоальвеолярного лаважа, чтобы ответить на дополнительные вопросы о характеристике воспалительной реакции. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как построить колонизацию Pseudomonas. Не забывайте, что работа с люминесцентными препаратами Candida может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение защитного снаряжения для предотвращения загрязнения воздушно-капельным путем.