Изучение микробных сообществ
13 января 2016 г.
В то время как in vitro изучение взаимодействий хозяина и патогена позволяет охарактеризовать специфические иммунные реакции, модели in vivo необходимы для наблюдения за эффектами сложных реакций. Используя воздействие Candida albicans с последующей инфекцией легких, опосредованной Pseudomonas aeruginosa, мы создали мышиную модель микробных взаимодействий, участвующих в патогенности ИВЛ-ассоциированной пневмонии.
Общая цель данной процедуры заключается в создании модели для изучения взаимодействий между отдельной бактерией и одним грибом. Этот подход поможет ответить на ключевые вопросы в области взаимодействия патогенов, например, о том, какие факторы участвуют в перекрестном взаимодействии и межвидовом «диалоге». Главным преимуществом данного метода является то, что данные, полученные с помощью этой модели in vivo, имеют клиническую значимость.
Для интраназального введения грибка сначала разведите C.albicans до концентрации 2 × 10⁶ CFU/мл в стерильном PBS. Затем, после подтверждения потери правильного рефлекса у взрослой гипотоничной мыши, наберите не менее 50 µl суспензии грибка в пипетку объемом 200 µl. Теперь зафиксируйте мышь одной рукой и переверните животное так, чтобы оно лежало на спине брюшком вверх.
Когда мышь зафиксирована в нужном положении, поддержите голову указательным пальцем руки, удерживающей животное, а большим пальцем удерживайте челюсть закрытой, и поднесите наконечник пипетки к носу животного. Затем осторожно нанесите каплю грибка объемом 50 µL на ноздри, чтобы мышь втянула ее при спонтанном дыхании. Поместите мышь в отдельную клетку до полного восстановления.
Через четыре дня после введения C.albicans выбрейте шерсть на брюшке эвтаназированного животного, затем проведите стерилизацию открытого участка кожи этанолом. Далее с помощью ножниц рассеките кожу от грудины до середины живота. Затем продлите разрез вдоль грудной клетки по обе стороны от срединной линии и отгните кожу в стороны от грудной полости.
Когда грудная клетка станет видна, сделайте вертикальный разрез по обеим сторонам груди в направлении ключиц, а затем, используя грудину, отклоните всю переднюю стенку грудной клетки, чтобы визуализировать сердце и легкие. Затем, используя предварительно гепаринизированный шприц, проколите сердце рядом с межжелудочковой артерией и заберите не менее 500 µL крови. Поместите образец крови на лед.
Затем сделайте срединный разрез в области шеи, чтобы обнажить трахею. Осторожно препарируйте фасцию вокруг трахеи, после чего наложите шов под трахеей. Затем с помощью модифицированной зондовой иглы калибра 20 G катетеризируйте трахею, зафиксировав канюлю ранее наложенным швом.
Для проведения бронхоальвеолярного лаважа осторожно введите 500 µL ледяного PBS в легкое. Затем аспирируйте лаважную жидкость и перенесите её в центрифужную пробирку объемом 2 мл на льду. После сбора еще двух образцов по 500 µL извлеките легкие из грудной клетки и поместите фрагмент легкого в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл для немедленного хранения при -80 °C.
Затем поместите еще один фрагмент легочной ткани в предварительно взвешенную пробирку для гемолиза с PBS на льду. В завершение сделайте разрез в левой части брюшной полости. Извлеките селезенку во вторую пробирку для гемолиза, содержащую 1 mL PBS, и поместите пробирку на лед.
Модель четырехдневной персистенции создается путем интраназального введения мышам C.albicans в дозе 5 × 10⁵ КОЕ на особь. В течение этих четырех дней у мышей наблюдается прибавка в весе, при этом признаки повреждения легких отсутствуют. Однако с увеличением количества КОЕ в инокуляте степень повреждения легких также возрастает.
Максимальное повреждение легких наблюдалось в период от 24 до 36 часов после инфицирования. Бактериальная нагрузка, напротив, снижается на один логарифм КОЕ на миллилитр каждые 24 часа, при этом ежедневно наблюдается рост кумулятивной диссеминации бактерий. В бронхоальвеолярном лаваже, полученном от инфицированных мышей, отмечается массированная рекрутация нейтрофилов; дифференциальный подсчет клеток показал, что инфильтрирующая популяция иммунных клеток состоит из 90% нейтрофилов и 10% макрофагов и лимфоцитов.
После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как анализ бронхоальвеолярного лаважа, чтобы получить дополнительные ответы по характеристике воспалительной реакции. После просмотра этого видео вы должны иметь четкое представление о том, как создать модель колонизации Pseudomonas. Не забывайте, что работа с люминесцентной Candida может быть крайне опасной, поэтому при выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование средств индивидуальной защиты для предотвращения капельного заражения.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании создана мышиная модель для изучения взаимодействий между Candida albicans и Pseudomonas aeruginosa в контексте вентилятор-ассоциированной пневмонии. Модель предназначена для выяснения сложных иммунных ответов, возникающих при взаимодействии этих патогенов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микробиология
- Иммунология
- Взаимодействия патогенов
Теоретические сведения
- Исследования in vitro позволяют получить представление об иммунных ответах.
- Модели in vivo необходимы для понимания сложных взаимодействий.
- Вентилятор-ассоциированная пневмония представляет собой серьезную клиническую проблему.
- Candida albicans и Pseudomonas aeruginosa являются распространенными патогенами при таких инфекциях.
Цель исследования
- Разработать модель для изучения взаимодействий между бактерией и грибком.
- Выявить факторы, участвующие в межвидовой коммуникации.
- Получить клинически значимые данные в ходе исследований in vivo.
Используемые методы
- Интраназальное введение Candida albicans мышам.
- Использование гипотонической модели мыши для наблюдения за реакциями.
- Оценка рефлекса выпрямления как показателя состояния здоровья.
- Анализ микробных взаимодействий в среде легких.
Основные результаты
- Создание надежной мышиной модели для изучения взаимодействий патогенов.
- Выявление ключевых факторов перекрестного взаимодействия между Candida и Pseudomonas.
- Демонстрация клинической значимости данной модели.
- Понимание механизмов патогенности вентилятор-ассоциированной пневмонии.
Выводы
- Разработанная модель эффективна для изучения сложных микробных взаимодействий.
- Полученные результаты способствуют пониманию патогенеза вентилятор-ассоциированной пневмонии.
- Будущие исследования могут использовать данную модель для изучения терапевтических вмешательств.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Моделирование опосредованных организмом хозяина взаимодействий между Candida albicans и Pseudomonas aeruginosa in vivo позволяет восполнить критический пробел в понимании полимикробной динамики, имеющей значение для инфекций дыхательных путей. Данный подход обеспечивает механистическую проверку терапевтических гипотез за счет учета сложности иммунного ответа и перекрестного взаимодействия патогенов, которые невозможно воспроизвести in vitro. Эта модель повышает прогностическую достоверность трансляционных исследований, направленных на борьбу с вентилятор-ассоциированными и хроническими инфекциями легких.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать сигнальные пути взаимодействия хозяина и патогена, а также межвидовые сигнальные пути в физиологически релевантном контексте.
- Способствует снижению биологических рисков за счет выявления профилей воспаления и привлечения иммунных клеток при коинфекции.
- Облегчает функциональную валидацию мишеней для вмешательств, модулирующих микробные взаимодействия или иммунные ответы.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает валидированную систему in vivo для последующего анализа популяций иммунных клеток и бактериальной нагрузки.
- Позволяет проводить количественную оценку инфильтрации нейтрофилов и макрофагов с помощью бронхоальвеолярного лаважа.
- Обеспечивает воспроизводимое измерение микробной нагрузки и повреждения тканей для оценки эффективности соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует моделям хронической инфекции легких и вентилятор-ассоциированной пневмонии, имеющим клиническое значение.
- Обеспечивает преемственность процесса от этапа поиска до доклинической валидации противоинфекционных или иммуномодулирующих стратегий.
- Поддерживает принятие решений о продвижении проекта с учетом рисков путем моделирования клинически значимых взаимодействий патогенов.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Эта модель in vivo связывает этапы ранних открытий и доклинических исследований, позволяя проверять гипотезы о взаимодействии микроорганизмов и иммунной системы в дыхательных путях. Она служит платформой для идентификации перспективных соединений и снижения рисков при изучении механизмов биологии инфекций.
- Открывающая биология: Обеспечивает анализ межцарственных взаимодействий патогенов и иммуномодуляции на основе выдвинутых гипотез.
- Скрининг: Позволяет получать количественные данные о патогенной нагрузке и привлечении иммунных клеток для сравнительных исследований.
- Аналитика: Обеспечивает статистический анализ микробной нагрузки, иммунной инфильтрации и повреждения тканей при различных экспериментальных условиях.
- Трансляционные исследования: Моделирует клинически значимые сценарии инфекции для оценки биомаркеров и терапевтических средств.
- Корпоративное повторное использование: Представляет собой воспроизводимую платформу in vivo, которую можно адаптировать для других исследований полимикробных сообществ или взаимодействий между хозяином и патогеном.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность в биологии инфекций.
- Операционная ценность: стандартизирует протоколы инфицирования in vivo и показатели иммунного ответа для обеспечения воспроизводимости.
- Стратегическая ценность: служит основой для принятия решений о продолжении или прекращении (go/no-go) программ разработки противоинфекционных и иммуномодулирующих средств.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритезацию кандидатов, нацеленных на полимикробные или иммуноопосредованные патологии, с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с моделями инфекций у мышей и анализа иммунных клеток.
- Необходим доступ к вивариям, соблюдение протоколов биобезопасности и наличие аналитической инфраструктуры для промывания и обработки тканей.
- Требуется стандартизация подготовки инокулята, времени инфицирования и сбора образцов между исследовательскими группами.
- Может потребоваться адаптация метода для различных видов микробов или генетических линий хозяина.
- При работе с люминесцентными штаммами Candida или инфекционными агентами необходимо строгое соблюдение мер предосторожности.
