Анти-вирулентных Срыв патогенных биопленки с помощью конструктивных Кворум-тушения Lactonases

Общая цель этого эксперимента — продемонстрировать эффективность ферментов, подавляющих кворум, в разрушении бактериальной биопленки. Этот метод поможет ответить на ключевые вопросы в области антибактериальной терапии, а также поможет понять влияние лактоназ, подавляющих кворум, на патогенные бактерии в биопленочной среде. Основное преимущество этого метода заключается в том, что лактоназы, подавляющие кворум, могут быть добавлены непосредственно в среде in vitro.

Таким образом, его влияние на разрушение биопленки легко поддается количественной оценке. Эту процедуру демонстрирует Терренс Тэй, техник нашей лаборатории. Для начала вырастите 5 миллилитровую культуру A.baumannii S1 в ЛБ при 30 градусах Цельсия в встряхивающем инкубаторе в течение 16 часов.

Отрегулируйте культуру до наружного диаметра 600, равного 0,8. Затем используйте свежий LB, содержащий 4 миллиграмма на миллилер очищенного фермента GKL, чтобы разбавить культуру один к 100. И добавьте 100 микролитров в лунки 96-луночной пластины.

Используйте крышки, чтобы накрыть тарелки, и поместите их в пластиковую емкость объемом 10 литров. Закройте контейнер и выдерживайте при температуре 30 градусов Цельсия в течение трех часов, прежде чем аккуратно удалить среду. Добавьте в лунки еще 100 микролитров свежей среды LB, и инкубируйте пластину при температуре 30 градусов Цельсия в течение 21 часа.

Аккуратно удалив среду, используйте 200 микролитров стерильной воды, чтобы аккуратно промыть клетки планктонных бактерий. Расположите наконечник пипетки на дне лунки и осторожно удалите жидкую среду, чтобы обеспечить минимальные возмущения на биопленке, находящейся между воздухом и жидкостью. Затем в каждую лунку добавить по 100 микролитров 1%-ного раствора кристаллического фиалки, и выдерживать 15 минут при комнатной температуре.

Удалите кристаллический фиолетовый раствор, используя 200 микролитров стерильной воды, чтобы трижды промыть лунки. Добавьте по 100 микролитров 33%-ной уксусной кислоты в каждую лунку и выдерживайте с легким встряхиванием в течение 15 минут, чтобы краситель растворился. Количественно оцените количество биопленки, измерив поглощение кристаллического фиолетового цвета на глубине 600 нанометров.

Количество кристаллического фиалки пропорционально количеству образующейся биопленки. Для проведения конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, или CLSM, биопленок A.baumannii S1 выращивают пятимиллитерную культуру A.baumannii S1 в LB при 30 градусах Цельсия в встряхивающем инкубаторе в течение 16 часов. Отрегулируйте культуру A.baumannii S1 до наружного диаметра 600 0,8.

Затем используйте свежий LB, содержащий 1,2 миллиграмма на миллилер очищенного фермента GKL, чтобы разбавить культуру, от одного до 100, и добавьте один миллилитр в микрочашку со стеклянным дном 35 миллиметров. Накройте микротарелку крышкой и поместите ее в 10-литровый пластиковый контейнер и закройте перед инкубацией чашки при температуре 30 градусов Цельсия в течение трех часов. Аккуратно удалив среду, добавьте один миллер свежей среды, содержащей 30 микролитров очищенного фермента GKL, затем инкубируйте при температуре 30 градусов Цельсия еще 21 час.

Аккуратно удалите среду во второй раз и замените еще одним миллилером фермента GKL в свежей среде. Выдерживать при температуре 30 градусов Цельсия в течение 24 часов. После инкубации аккуратно извлеките среду и добавьте 500 микролитров по пять микрограмм на миллилитр конъюгированного агглютинина зародышей пшеницы Alexa Fluor 488, растворенного в HBSS.

Инкубируйте микрочашку при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут, чтобы окрасить биопленки. Чтобы закрепить биопленки, добавьте 500 микролитров 3,7%-ного формальдегида, растворенного в HBSS, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Используйте два миллилитра HBSS, чтобы вымыть микротарелку один раз, затем полностью удалите раствор.

Храните тарелку в темноте при температуре четыре градуса Цельсия перед визуализацией CLSM. Для визуализации и анализа CLSM используйте объектив 63X для создания 97 стеков на изображение с интервалом 0,21 мкм на стек. В эксперименте по количественному определению кристаллического фиолета GKL дикого типа и улучшенный фермент GKL с двойным мутантным подавлением кворума были использованы для измерения активности лактоназы против трех гидроксидеканоил-гомосериновых лактонов или 3OHC10HSL, основной молекулы кворума, используемой A.baumanii S1.As показано здесь, оба фермента смогли значительно снизить образование биопленок в предварительно обработанном A.baumanii S1 дикого типа. Степень разрушения биопленок обоими ферментами не пропорциональна их эффективности в отношении 3OHC10HSL.

Как видно из этой таблицы, скорость оборота мутантного GKL в шесть раз выше, чем у GKL типа Wild против 3OHC10HSL. Однако разница в степени разрушения биопленок между ферментами лишь двукратна. В этом эксперименте для сравнения использовали улучшенный мутантный фермент GKL и его катехолически неактивный фермент.

Это изображение DIC показывает, что лечение улучшенным мутантным ферментом GKL привело к уменьшению размера биопленки по сравнению с неактивным ферментом. Анализ флуоресцентных изображений также показал, что при обработке улучшенным мутантным ферментом GKL наблюдалось уменьшение площади поверхности, биомассы и средней толщины биопленок. После освоения этой техники ее можно выполнить за три-четыре часа, не считая времени инкубации, если она выполнена правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что необходимо свести к минимуму удаление и разрушение биопленки на этапах промывки. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как подсчет клеток и анализ стабильности ферментов. Это даст ответы на дополнительные вопросы, такие как влияние лактоназ, подавляющих кворум, на клеточную популяцию в биопленке, а также продолжительность их действия.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области лечения инфекционных заболеваний к изучению эффектов потенциальных лактоназ, подавляющих кворум, в биопленке, производимой патогенными бактериями. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как количественно оценить разрушение биопленки при окрашивании кристаллическим фиолетовым цветом, а также оценить морфологические изменения в биопленке с помощью конфокальной визуализации. Не забывайте, что работа с патогенным материалом может быть крайне опасной.

При выполнении этой процедуры всегда следует принимать меры предосторожности, такие как использование надлежащих средств для ограничения биологического риска.