С помощью Экс Vivo Вертикальный воздушно-капельных Культуры всей фетальных органов по изучению процессов развития во Mouse органогенеза

Общая цель этой процедуры заключается в изучении влияния низкомолекулярных ингибиторов на развитие органов плода с использованием техники культивирования капель ex vivo. Это достигается путем вскрытия брюшины беременной мыши и удаления эмбриона, содержащего матку. Далее эмбрионы извлекаются из матки и освобождаются от желтка и околоплодных мешочков.

Затем комплекс goad me neph препарируют и выделяют из эмбриона. Наконец, комплекс Goad Meris культивируют в виде капли с ингибитором малых молекул или без него. В конечном счете, иммунофлуоресцентная микроскопия используется для выявления изменений в архитектуре органов с использованием антител, специфичных для клеточного типа.

Таким образом, преимущество нашей прямостоячей каплевидной культуры всего органа ex vivo по сравнению, скажем, с линиями клеточных культур, заключается в том, что она имеет трехмерную структуру, дающую начало клеточным взаимодействиям из-за локальности, а также внеклеточной матрической сигнализации, которая может быть важна для формирования органов и структурирования. Кроме того, наша технология вертикального нанесения капель позволяет использовать меньше реагентов, тем самым снижая стоимость и потенциальную токсичность из-за побочных эффектов. Это преимущество по сравнению с другими методами работы с целым органом, и оно по-прежнему позволяет диффузию фармакологических агентов к органу-мишени.

Хотя этот метод может дать представление о сосудистом развитии яичек плода, он также может быть применен к другим органам плода, таким как легкие, и мы также можем использовать его для исследования различных биологических процессов. Существуют и другие клеточные сигнальные пути во время внутриутробного развития при Е 11,5. После усыпления беременной мыши, согласно тексту, используйте 70% этанол, чтобы распылить на живот тонкими ножницами.

Сделайте V-образный разрез, чтобы открыть кожу живота и брюшины, и оттяните лоскут ткани, чтобы обнажить передние органы. Расположите яичники на обоих концах маточного рога, затем ножницами разрежьте яичник и соединительную ткань, чтобы отделить матку, содержащую эмбрионы, от тела матери. Далее вскройте стенку матки, аккуратно разрезав сторону, противоположную плаценте, обнажив желточные мешки.

Будьте осторожны, чтобы не проколоть желточный мешок, чтобы не повредить или не потерять эмбрионы. Затем разрежьте рядом с плацентой, чтобы удалить мешочки с желтком, содержащие эмбрион, и поместите их в чашку, содержащую PBS с кальцием и магнием, которые помогут поддержать молекулы клеточной адгезии для поддержания архитектуры тканей и предотвратить прилипание ткани к инструментам. С помощью щипцов удалите желточный мешок и амнион из эмбриона, осторожно проколов желточный мешок, чтобы создать отверстие, в котором эмбрион может выскользнуть. Как только эмбрион окажется за пределами желточного мешка, перережьте пуповину.

С этого момента следует использовать микроскоп, расположенный в капюшоне для стерильных тканей. Удалите голову эмбриона с помощью щипцов, чтобы ущипнуть с любой стороны шеи, выбросьте голову, удалите хвост и поместите его в новую микроцентрифужную пробирку для анализа X-Y-P-C-R для определения пола эмбриона. Теперь закрепите эмбрион в лежачем положении на дне чашки для культивирования, используя пару щипцов, чтобы прижать подмышки эмбриона еще одной парой щипцов.

Снимите кожу, покрывающую живот, и аккуратно удалите печень, кишечник и другие органы, чтобы обнажить заднюю стенку тела, где расположен урогенитальный гребень. Используйте щипцы, чтобы зачерпнуть под урогенитальный гребень, осторожно открыв щипцы и подняв их вверх. Удалите урогенитальный гребень.

Следите за тем, чтобы не повредить половые железы. Перенесите урогенитальный гребень в чашку C-D-M-E-M для акклиматизации ткани к среде с помощью игл 27 калибра, чтобы отделить комплекс Sphs гонады от остальной части урогенитального моста. Используйте одну иглу для разреза, надавливая вниз, а другую для правильного направления ткани, чтобы обеспечить оптимальное разделение для культуры.

Гонаду с низкомолекулярным ингибитором установите две пипетки по 20 микролитров по 15 микролитров каждая с помощью чистого стерилизованного бритвенного лезвия. Отрежьте примерно один-два миллиметра от одного из барьерных наконечников пипетки для переноса половых желез и добавления контрольных C-D-M-E-M. Выровняйте гонады так, чтобы их длинная ось была параллельна наконечнику пипетки, чтобы их можно было легко пипетировать с помощью отрезанного наконечника Пометьте одну сторону 35-миллиметровой крышки посуды как контрольную каплю, а другую — как каплю, содержащую лекарственный препарат.

Убедитесь, что этикетки на крышках совпадают с этикетками на хвостовой ткани, содержащей микроцентрифужные пробирки. Пипетка 15 микролитров C-D-M-E-M, содержащей одну гонаду, в каплю на крышке. Следите за тем, чтобы гонады не прилипли к внутренней стороне наконечника пипетки, и повторите то же самое со второй каплей с другой стороны.

Проверьте под микроскопом, что половые железы были перенесены в каплю, обозначенную как контрольная. С помощью контрольной пипетки добавьте еще 15 микролитров C-D-M-E-M, содержащего ДМСО, чтобы получить каплю объемом 30 микролитров к другой капле. С помощью предназначенной для этого препарата пипетки добавьте 15 микролитров ИТК два раза в C-D-M-E-M с помощью пипетки.

Распределите капли по кругу, пока они не достигнут диаметра от 15 до 18 миллиметров, а гонада не будет расположена примерно посередине. Ориентируйте гонаду так, чтобы она лежала на боку, и повод и мессины будут легко различимы. Сориентируйте легкие так, чтобы две доли лежали ровно и удерживались на месте за счет поверхностного натяжения, не касаясь друг друга.

Осторожно поместите крышку чашки для культуры вертикально и положите ее плашмя на поверхность воды в большую миску для увлажнителя, следя за тем, чтобы под ней не было пузырьков и вода не попала внутрь крышки. Чтобы создать маленькую увлажненную камеру, немедленно накройте большую посуду крышкой, убедившись, что крышки маленькой посуды могут свободно перемещаться в большой посуде и что может происходить воздухообмен. После того, как две маленькие крышки помещены в камеру, немедленно поместите камеру в инкубатор с углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия на 48 часов.

Проводят ПЦР и иммунофлюоресценцию согласно текстовому протоколу. При культивировании с использованием системы культивирования капель Exvivo комплексы СPHS фетальной гоны имеют высокую выживаемость, как показано здесь. Сравнение гонад E 11.5 в начальной инкубации с 24 или 48 часами в культуре показывает резкое изменение формы гонад и появление полосообразных структур шнура в контрольной гонаде XY, как показано здесь.

Система капельного культивирования может воссоздать события дифференцировки яичек ex vivo, поскольку можно визуализировать девять положительных клеток сертоли SOX в гонадах XY, формирующихся в тубоподобные тяжи, и сосудистую сеть, формирующуюся по всему органу. В легких 48-часовое бактериологическое исследование приводит к усилению ветвления девяти эко-герринов с двойным положительным эпителием. Несмотря на некоторое увеличение количества апоптотических клеток в легких, в тех же условиях культивирования аналогичные уровни апоптоза наблюдаются в контрольной группе и в утробе матери.

Гонады свидетельствуют о том, что гонады особенно поддаются условиям культивирования. Для изучения эффектов васкуляризации и ремоделирования сосудов в морфогенезе яичек был использован низкомолекулярный ингибитор ИТК-2, который блокирует активность рецепторов VEGF. Результаты показывают, что нарушение сосудистого ремоделирования в яичке плода эффективно в системе культивирования капель, и последующие дефекты морфогенеза спинного мозга яичка могут быть визуализированы после этой процедуры.

Другие методы, такие как количественная ПЦР в реальном времени, секвенирование РНК нового поколения или проточная цитометрия, могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, как различные фармакологические реагенты влияют на экспрессию белка или генов, представляющих интерес. Кроме того, мы можем использовать покадровую визуализацию в реальном времени для визуализации клеточной динамики в режиме реального времени, если используются трансгенные флуоресцентные эмбрионы. Кроме того, доступен широкий спектр реагентов для нацеливания на сигнальные пути кандидатов, которые могут быть вовлечены в органогенез плода.

Эти методы помогут нам понять основные механизмы, которые управляют развитием плода. После просмотра этого видео вы сможете проводить посевы всего органа ex vivo в вертикальном положении капли, чтобы выяснить сигнальные пути во время органогенеза плода. Этот метод включает в себя препарирование эмбрионов в середине гестационного периода, выделение органов-мишеней и подготовку вертикальных капельных культур для инкубации этих органов с фармацевтическими реактивами.