Оценка иммуномодулирующими свойствами человеческой мезенхимальных стволовых клеток (МСК)
24 декабря 2015 г.
Иммуномодулирующих свойств мезенхимальных стволовых клеток человека (MSC) появляются все более актуальным для клинического применения. Используя систему совместного культивирования МСК и лейкоцитов периферической крови до окрашенных с карбоксифлуоресцеина флуоресцентный краситель сукцинимидиловым эфира (CFSE), мы опишем оценку MSC иммуномодуляцию в пробирке на пролиферацию эффекторных лейкоцитов и конкретных групп населения.
Общая цель данного эксперимента — оценить иммуномодулирующие свойства мезенхимальных стволовых клеток человека (msc). Этот метод может помочь выяснить механизмы, участвующие в иммуномодуляции мезенхимальными стволовыми клетками человека, что может иметь терапевтическое значение. Основным преимуществом данной методики является возможность оценки как пролиферации эффекторных лейкоцитов, так и количества клеточных делений, что позволяет детально продемонстрировать ход процедуры.
Лаборант из моей лаборатории. Для выделения pbmc начните с разведения 25 мл образца гепаринизированной цельной крови 25 мл PBS в конической пробирке объемом 50 мл. Затем добавьте 15 мл градиента плотности Ficoll-Paque в новую пробирку объемом 50 мл. После этого, удерживая пробирку под углом, медленно наслоите разведенную клеточную суспензию поверх градиента плотности.
Соблюдение этих мер предотвращает смешивание слоев. Одним из наиболее критических этапов данного эксперимента является осторожное нанесение крови, чтобы не нарушить градиент плотности. Это необходимо для обеспечения высокой чистоты и низкого уровня загрязнения эритроцитами выделенных PBMC.
Теперь отделите клетки путем центрифугирования. Должны стать видны три отчетливых слоя: верхний слой плазмы, нижний слой градиента плотности Ficoll и тонкий средний слой PBMC.
С помощью ПЭ-пипетки удалите верхний слой, стараясь не засасывать слой интерфазы. Затем с помощью пипетки на 10 мл осторожно перенесите PBMC в коническую пробирку объемом 50 мл. Смешайте клетки с 20 мл PBS, а затем центрифугируйте их для удаления всех следов градиента плотности.
Затем промойте осадок еще в 20 миллилитрах PBS, чтобы удалить тромбоциты. Ресуспендируйте второй осадок в полной среде для лейкоцитов до концентрации 1 × 10⁷ клеток на миллилитр. Для создания совместной культуры MSC и лейкоцитов предварительно прогрейте полную среду для MSC до 37 °C не более чем на 30 минут.
Затем высейте 5 × 10⁴ MSC на один миллилитр полной среды MSC в каждую лунку 24-луночных планшетов для прикрепления клеток в течение ночи при 37 °C до достижения 80% конфлюэнтности. На следующее утро аспирируйте среду и добавьте соответствующее количество помеченных CFSE PBMC к MSC в одном миллилитре полной среды для лейкоцитов. При соотношении MSC к PBMC 1:10 активируйте клетки, добавив 10 мкг PHA на миллилитр полной среды для лейкоцитов.
Затем на третий и пятый дни совместного культивирования перенесите соответствующее количество совместных культур в пробирки с круглым дном и оцените пролиферацию лейкоцитов, меченных CFSE, с помощью проточной цитометрии для проведения анализа супрессии эффекторных клеток. Начните с создания совместной культуры MSC и PBMC, как было продемонстрировано ранее, используя 2,5 × 10⁶ PBMC в совместной культуре с 250 000 MSC. Это необходимо для обеспечения достаточного количества PBMC в совместной культуре с MSC для отбора субпопуляций.
После инкубации в течение 48–72 часов при 37 °C выберите интересующие вас иммуномодулирующие лейкоциты, индуцированные MSC, с помощью соответствующих магнитных бусин. Затем добавьте аллогенные CD4-положительные T-клетки, меченные CFSE, в 1 мл полной среды для лейкоцитов на лунку в различных экспериментальных соотношениях. Далее добавьте микробусины, конъюгированные с anti-CD3, в соотношении 1:1 (бусина к клетке) для стимуляции CD4-положительных T-клеток.
На третий день совместного культивирования оцените пролиферацию меченых CFSE CD4-положительных Т-клеток методом проточной цитометрии. МСК представляют собой адгезивные клетки с фибробластической веретеновидной морфологией, в то время как PBMC и лейкоциты являются небольшими круглыми неадгезивными клетками, что позволяет четко различать эти две популяции клеток. В совместной культуре при отсутствии пролиферации меченые CFSE клетки наблюдаются как один высокоположительный и резко выраженный флуоресцентный пик после активации клеток.
Пролиферация проявляется в виде нескольких более мелких пиков с потерей и сдвигом влево интенсивности флуоресценции в случаях, когда произошло подавление пролиферации. Например, в кокультуре МСК количество мелких пиков уменьшается с сопутствующим увеличением интенсивности флуоресценции, что подтверждается сдвигом пиков вправо и увеличением остроты самого правого пика, который представляет неделящиеся клетки в анализе супрессорного действия эффекторных клеток. Супрессивный эффект МСК на пролиферацию CD4-положительных Т-клеток может быть дополнительно оценен в зависимости от дозы.
После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как оценивать иммуномодулирующую активность мезенхимальных стволовых клеток человека. Не забывайте, что работа с клетками человека может быть опасной и всегда следует соблюдать меры предосторожности.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании изучаются иммуномодулирующие свойства мезенхимальных стволовых клеток (МСК) человека с использованием системы совместного культивирования с лейкоцитами периферической крови. Основное внимание при оценке уделяется пролиферации эффекторных лейкоцитов и специфических субпопуляций, что подчеркивает потенциальную терапевтическую значимость МСК.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Исследования стволовых клеток
- Пролиферация клеток
Теоретическая часть
- Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) человека обладают иммуномодулирующими свойствами.
- Понимание взаимодействий МСК с лейкоцитами имеет решающее значение для терапевтического применения.
- Пролиферация эффекторных лейкоцитов является ключевым аспектом иммунного ответа.
- Системы кокультивирования позволяют эффективно моделировать эти взаимодействия in vitro.
Цель исследования
- Оценить иммуномодулирующее воздействие МСК на пролиферацию лейкоцитов.
- Выяснить механизмы иммуномодуляции МСК.
- Изучить терапевтическую значимость МСК для клинического применения.
Используемые методы
- Система совместного культивирования МСК и лейкоцитов периферической крови.
- Использование сукцинимидного эфира карбоксифлуоресцеина (CFSE) для отслеживания клеток.
- Оценка пролиферации эффекторных лейкоцитов.
- Анализ специфических субпопуляций лейкоцитов.
Основные результаты
- Продемонстрирована модуляция пролиферации лейкоцитов, индуцированная МСК.
- Идентифицированы специфические субпопуляции, на которые воздействуют МСК.
- Получены данные о механизмах иммуномодуляции МСК.
- Подчеркнут терапевтический потенциал МСК.
Выводы
- МСК оказывают значительный иммуномодулирующий эффект на лейкоциты.
- Полученные результаты подтверждают возможность терапевтического применения МСК в клинических условиях.
- Необходимы дальнейшие исследования для полного понимания задействованных механизмов.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Оценка иммуномодулирующей функции МСК с помощью анализа пролиферации лейкоцитов с использованием CFSE представляет собой количественный и воспроизводимый метод оценки терапевтического потенциала при иммуноопосредованных заболеваниях. Данный подход способствует валидации мишеней, позволяя снизить механистические риски, связанные с иммуносупрессией, опосредованной МСК, перед началом доклинических инвестиций. Адаптируемость анализа к конкретным субпопуляциям лейкоцитов повышает прогностическую точность при выборе ведущих кандидатов для разработки иммуномодулирующих препаратов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать подавление пролиферации эффекторных лейкоцитов под воздействием МСК в качестве функционального показателя иммуномодулирующей активности.
- Практическая ценность: предоставляет стандартизированный метод количественного анализа истории деления и кинетики пролиферации на основе использования меток без применения радиоактивности.
- Научная ценность: обеспечивает возможность фенотипического скрининга доноров МСК или стратегий предварительной подготовки путем измерения подавления пролиферации лейкоцитов, меченных CFSE.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет изолировать и отслеживать специфические подмножества лейкоцитов (например, CD4+ T-клетки) с помощью магнитной сепарации перед совместным культивированием, что дает возможность профилирования иммуномодуляции для конкретных подмножеств.
- Практическая ценность: профили разведения CFSE, полученные методом проточной цитофлуориметрии, предоставляют количественные многопараметрические данные о подавлении пролиферации и истории деления клеток.
- Научная ценность: облегчает оценку зависимости «доза-эффект» иммуномодуляции MSC при различных соотношениях MSC:лейкоциты и условиях активации (например, при стимуляции PHA).
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Связывает иммуномодулирующую активность in vitro с потенциальной клинической эффективностью при иммунозависимых заболеваниях путем моделирования взаимодействия между МСК и лейкоцитами.
- Практическая ценность: Позволяет проводить лонгитюдный отбор проб (например, на 3-й и 5-й дни) для оценки временной динамики супрессии и восстановления.
- Научная ценность: Обеспечивает оценку с привязкой к биомаркерам путем корреляции подавления пролиферации с экспрессией внутриклеточных цитокинов в лейкоцитах совместного культивирования.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Анализ пролиферации лейкоцитов на основе CFSE интегрируется в рабочие процессы раннего поиска в качестве инструмента функционального иммуномодулирующего скрининга, связывая этапы валидации мишени и оптимизации ведущих соединений для терапевтических средств на основе МСК.
- Фундаментальная биология: позволяет проверить гипотезу о том, что МСК подавляют пролиферацию лейкоцитов, обеспечивая понимание механизмов иммуносупрессивных путей.
- Скрининг: предоставляет воспроизводимые количественные показатели пролиферации, что позволяет сравнивать партии МСК, доноров или условия прайминга.
- Аналитика: позволяет получать данные проточной цитометрии, способные разрешать пики пролиферации, отслеживать деления и специфические ответы подмножеств в гетерогенных популяциях лейкоцитов.
- Трансляционные исследования: моделирует взаимодействия иммунных клеток человека с МСК in vitro, что способствует экстраполяции результатов на клинические контексты иммуномодуляции.
- Корпоративное повторное использование: создает модульную, адаптируемую платформу, применимую для различных типов иммунных клеток и условий стимуляции, релевантных для конкретных заболеваний.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность, предоставляя прямые количественные доказательства подавления лейкоцитов, опосредованного МСК.
- Практическая ценность: Обеспечивает стандартизацию анализа за счет определенных соотношений МСК:лейкоциты, протоколов маркировки CFSE и стратегий гейтирования при проточной цитометрии.
- Стратегическая ценность: Повышает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») за счет раннего выявления МСК с мощной и воспроизводимой иммуномодулирующей активностью.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию кандидатов МСК с учетом рисков, основываясь на функциональной силе иммуномодуляции, а не только на фенотипических маркерах.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области первичного выделения лейкоцитов, маркирования CFSE и многоцветного анализа методом проточной цитометрии.
- Зависит от наличия проточных цитометров, способных разрешать пики разведения CFSE, и систем магнитного сепарирования для выделения субпопуляций.
- Необходимо стандартизировать условия активации лейкоцитов (например, концентрацию PHA) и протоколы предварительного культивирования MSC во всех центрах.
- Требуется оптимизация соотношения MSC:лейкоциты и продолжительности совместного культивирования во избежание артефактов, связанных с избыточным ростом клеток или истощением питательных веществ.
- Ограничено вариабельностью ответа лейкоцитов разных доноров, что требует использования пулированных образцов или подобранных донорских контролей для получения воспроизводимых показателей супрессии.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Title
0:44
Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Isolation
2:23
MSC: Leukocyte Co-culture and Leukocyte Activation
3:31
Variation: Effector Suppression Assay
4:38
Results: Representative Suppressive Effects of MSC on Leukocyte Proliferation
5:51
Conclusion
