Обнаружение внутриклеточных экспрессии генов в живых клетках мышиных, человеческого и свиного происхождения с помощью флуоресцентной меченных наночастиц

Общая цель данной процедуры заключается в анализе внутриклеточной экспрессии генов непосредственно в живых клетках путем применения ген-специфических флуоресцентных наночастиц. Это достигается путем первоначального определения соответствующих целевых последовательностей в интересующем гене. Вторым этапом является изготовление наночастиц со специфическими захватывающими и репортерными нитями.

Затем наночастицы добавляют непосредственно в культуральную среду живых клеток. Заключительным этапом является инкубация клеток с наночастицами в течение ночи при 37 °C и 5% CO2 в увлажненной атмосфере. В конечном итоге для визуализации ген-специфической флуоресценции в живых клетках-мишенях используется флуоресцентная микроскопия, а для количественного определения числа флуоресцентных клеток — проточная цитометрия.

Основное преимущество данного метода перед существующими способами, такими как иммуногистохимия, молекулярные маяки или ПЦР-анализ, заключается в том, что экспрессия генов может быть визуально наблюдаема в живых клетках без какого-либо манипулирования клеточной культурой. Процедуру продемонстрируют Мартина Тереза, биолог и аспирантка нашей лаборатории, и Линетт Хенкель, в части проточной цитометрии. После определения целевых последовательностей закажите лиофилизированные золотые наночастицы из имеющихся в продаже источников.

Эти частицы состоят из центральной золотой частицы, ковалентно связанной с захватывающим праймером, который, в свою очередь, связан с репортерным праймером. Когда целевая мРНК связывается с захватывающим праймером, репортерный праймер и связанный с ним флуорофор высвобождаются в раствор, что позволяет Fluor four излучать флуоресценцию. Перед восстановлением.

Наночастицы следует хранить при температуре 4 °C в темноте в картонной коробке. Для восстановления золотых наночастиц добавьте 20 µL дважды дистиллированной воды, чтобы получить конечную концентрацию 100 nM. Восстановленные наночастицы могут храниться при комнатной температуре в темноте не менее одного года.

В день проведения процедуры разведите стоковый раствор наночастиц золота до 20-кратного рабочего раствора в PBS. Извлеките из инкубатора для культур клеток 24-луночный планшет с клетками HEK 2 93, аспирируйте среду, затем добавьте 237,5 µL свежей культуральной среды. После этого внесите пипеткой 12,5 µL рабочего раствора наночастиц в каждую подготовленную лунку и осторожно перемешайте планшет круговыми движениями для равномерного распределения наночастиц. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 °C и 5% CO2 в увлажненной атмосфере. На следующий день.

Проанализируйте клеточные культуры на наличие специфической флуоресценции сайта 3 с помощью стандартного флуоресцентного микроскопа, чтобы подготовить клетки для проточной цитометрии. Один раз промойте клетки HEK 2 9 3, демонстрирующие индуцированную флуоресценцию сайта 3, раствором PBS и добавьте 1 mL 0,05% трипсина-EDTA; инкубируйте клетки в течение 3 минут при 37 °C и 5% CO2. После инкубации добавьте 0,5 mL среды CO и перемешайте содержимое с помощью пипетирования.

Затем перенесите клетки в пробирку объемом 15 миллилитров. Добавьте три миллилитра культурной среды и центрифугируйте пробирку в течение пяти минут при 300 ×g. Затем удалите супернатант и ресуспендируйте клетки в 200 µL ледяного FACS-буфера. Перенесите клетки в пробирку объемом 1,5 миллилитра и храните их на льду в темноте до проведения анализа.

Перед проведением анализа методом проточной цитометрии пропустите клетки через фильтр с размером пор 30 мкм для предотвращения агрегации клеток. Затем добавьте к клеткам пропидий иодид до конечной концентрации 2 мкг/мл минимум на две минуты, перемешайте суспензию клеток на вортексе и установите пробирку с образцом в проточный цитометр. Для обнаружения SI три позитивных клеток.

Используйте необработанные контрольные клетки для настройки иерархических гейтов по параметрам прямого светорассеяния (FSC area) относительно бокового светорассеяния (SSC area), высоты FSC относительно FSC с подмножеством, а также высоты SSC относительно SSC с подмножеством, чтобы исключить клеточный дебрис и неспецифически рассеивающие клетки. Удалите мертвые клетки из анализа на основании окрашивания пропидиумйодидом, отобразив канал PE относительно канала PE Texas Red, после чего установите финальный гейт сортировки на PE-положительных клетках в третьем окне. Детекция GA dh.

Для подтверждения экспериментальной осуществимости была проведена экспрессия конститутивно экспрессируемого гена «домашнего хозяйства» в клетках HEK 2 93. Наночастицы с перемешанной последовательностью (отрицательный контроль) демонстрируют слабую или отсутствующую флуоресценцию, в то время как положительный контроль по захвату permanently fluorescing демонстрирует постоянную флуоресценцию. Контрольные образцы показывают сильный сигнал после инкубации в течение ночи.

Было показано, что эти наночастицы специфически определяют экспрессию генов маркеров плюрипотентных стволовых клеток nano и GDF3 в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (ИПСК) человека и свиньи. Важно отметить, что данные маркеры обнаруживались только в ИПСК и отсутствовали в фибробластах, которые использовались в качестве фидерного слоя при культивировании ИПСК. Для оценки эффективности мечения наночастиц GA DH использовали как визуальный, так и количественный анализ с помощью проточной цитометрии при градиентном введении наночастиц от 0 до 1000.

Эксперимент с PICOMOLAR проводился на клетках HEK 293, которые продемонстрировали четкое концентрационно-зависимое увеличение флуоресценции. Затем был проведен количественный анализ в эмбриональных стволовых клетках мыши, в которых после добавления 400 наночастиц PICOMOLAR GA DH наблюдалось примерно 40% CY three-положительных клеток. Аналогичные значения были получены для маркеров плюрипотентности.

Как только освоены Nano и GDF 3, эту методику можно выполнить в течение 16 часов при правильном подходе. После просмотра этого видео вы должны хорошо понять, как использовать ген-специфические наночастицы для детектирования внутриклеточной экспрессии генов непосредственно в живых клетках с помощью флуоресцентной микроскопии.