Эпителиальные Репопуляции сотовый и подготовка грызунов внеклеточный матрикс строительные леса для почечной ткани развития

Общая цель этой процедуры заключается в повторном заселении абесклеточных трехмерных каркасов внеклеточного матрикса почек грызунов эпителиальными клетками почечной системы человека. Это достигается путем первой децеллюляризации, почки боярышной крысы с помощью ряда растворов моющих средств, перфузии через почечную артерию в течение 26 часов. Затем почку стерилизуют, и в бесклеточный каркас почечной внеклеточного матрикса вводят 40 миллионов клеток эпителиального канальца коры головного мозга человека или РХТЭ при непрерывной антеградной артериальной перфузии в специально разработанной реакторной системе Biore.

В конечном счете, способность клеток РХТЭ повторно заселять каркас почки может быть оценена с помощью ЭР, перфузионного анализа и иммуногистохимического анализа. Этот метод 3D-культивирования клеток позволяет исследователям повторно заселять весь внеклеточный матрикс органа. Скеффолдные клетки откладываются в перитубулярном пространстве во внеклеточном матриксе для исследования и связывания факторов, влияющих на рост, дифференцировку и созревание клеток.

Основное преимущество этого метода по сравнению с альтернативными методами, такими как изготовление синтетических полимерных каркасов, заключается в том, что почечный внеклеточный матрикс способствует адгезии, пролиферации и созреванию перфузированных клеток в сложной сети естественных структурных белков, факторов роста и других биологических компонентов. Начните процедуру децеллюляризации, подсоединив катетер почечной артерии каждой размороженной почки к концу трубки перфузионного контура после насоса, следя за тем, чтобы в катетере не попали пузырьки воздуха. Если в катеттере присутствуют пузырьки воздуха, используйте микропипетку объемом 200 микролитров, чтобы вытянуть пузырьки и заполнить катетер жидкостью.

Подвесьте почку вдоль внутренней стенки пустого пятилитрового стакана так, чтобы почечная артерия не перегнулась и не скрутилась, и отрегулируйте привод насоса на пять миллилитров в минуту. Затем нажмите кнопку «Пуск» после подтверждения того, что каждая почка перфузируется, наблюдая за капанием растворов со дна органа и каждой почки с соответствующими растворами, как указано в технологической схеме в конце перфузии. Храните децеллюляризованные почки в PBS в конической трубке объемом 50 миллилитров при температуре четыре градуса Цельсия или максимум два. После сборки контура перфузии снимаем красную винтовую крышку с головки биореактора и пипаем 50 мл раствора уксусной кислоты 0,1% уксусной кислоты, 4% этанола в резервуар среды через отверстие.

С помощью большого картриджа насоса подсоедините сегмент перистальтической трубки насоса к головке насоса. Затем отрегулируйте расход до пяти миллилитров в минуту. Нажмите «Пуск» и дайте контуру заправиться, когда жидкость заполнит линию насыщения и достигнет оставшегося открытого порта трехходового запорного крана.

Используйте штекер для приманки, чтобы заглушить порт. Дайте контуру полностью заполниться до тех пор, пока в трубке перфузионного контура или на внутренней стороне входного отверстия не останется воздуха. Акцептор приманки вытесняет пузырьки из контура перфузии за счет временного увеличения расхода насоса.

Когда система будет полностью заполнена, остановите привод насоса и простерилизуйте шестидюймовые щипцы. Чтобы аккуратно вставить самку приманкой конца катетера почечной артерии в мужское входное отверстие, приманьте акцептор на внутренней поверхности головки биореактора, убедившись, что соединение плотно и что в катетере не осталось воздуха. Позвольте почки аккуратно свисать с катетера почечной артерии, чтобы почечная артерия не перекручивалась и не перегибалась.

Затем затяните металлический зажим, удерживающий головку и корпус биореактора вместе, чтобы резервуар биореактора был плотно закрыт, и закройте завинчивающуюся крышку. Теперь простерилизуйте почки при комнатной температуре, перфузией раствора этанола уксусной кислоты в количестве пяти миллилитров в минуту. Через час остановите насос и откройте красную винтовую крышку.

Используя стерильных средств от вредителей, пипетка тщательно отсасывает весь раствор из резервуара биореактора. Затем пипеткой внесите 50 миллилитров свежего PBS в резервуар биореактора. Закройте завинчивающуюся крышку и запустите насос на три последовательные часовые перфузии при комнатной температуре со скоростью пять миллилитров в минуту.

После окончательной промывки PBS отоберите солевой раствор из резервуара и добавьте 50 миллилитров среды в резервуар с закрытой завинчивающейся крышкой. Перенесите биореактор с присоединенным контуром перфузии в инкубатор большой емкости при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Затем подключите контур перфузии биореактора к насосу и перфузируйте почки со скоростью четыре миллилитра в минуту в течение как минимум одного часа до посева.

Для целлюляризации почки собирают достаточное количество культуральных колб для нужной концентрации сидения. Затем, после аспирации питательной среды из каждой колбы, используйте 10 миллилитров соответствующего фермента, диссоциирующего клетки, чтобы поднять эпителиальные клетки коры головного мозга почек из колбы при температуре 37 градусов Цельсия. Через 10 минут начинайте проверять колбы на лицевой контрастный микроскоп каждые две минуты до тех пор, пока не будет наблюдаться отслоение складок.

Затем, взяв небольшую аликвоту клеток для подсчета, разводят ассоциированную клеточную суспензию в равном объеме предварительно подготовленной среды и центрифугируют клетки для подсчета. Суспензию гранулы сопровождают соответствующим объемом питательной среды до получения конечной концентрации от двух до 10 до семи клеток на миллилитр. Перелейте два миллилитра сидячей суспензии в 35-миллиметровую культуральную чашку, а затем наберите два миллилитра объема в стерильный пятимиллилитровый шприц.

Перенесите перфузионный биореактор в шкаф биологической безопасности и поверните запорный кран, чтобы перекрыть поток к посадочному отверстию. Снимите слип приманки с наружной резьбой, отсоедините заглушку от стопорного крана и подсоедините шприц. Затем быстро перенесите контур перфузии обратно в инкубатор и с помощью большого картриджа насоса закрепите сегмент трубки перистальтического насоса на головке насоса для установки ячеек.

Закройте порт запорного крана, направленный в сторону насоса, и медленно введите клетки в каркас почки. Затем поверните клапан запорного крана, чтобы перекрыть поток из шприца, и запустите насос со скоростью 25 миллилитров в минуту. Через 15 минут уменьшите расход насоса до четырех миллилитров в минуту, заменяя среду на следующий день и каждые два дня в дальнейшем.

Для оценки жизнеспособности и пролиферации клеток асептически замените питательную среду с 10 миллилитрами рабочего раствора зарина на перфузии почечных каркасов со скоростью 4 миллилитра в минуту ровно через один час, соберите кондиционированный и частично восстановленный раствор зарина и проведите еще одну перфузию со скоростью 4 миллилитра в минуту. При введении 100 миллилитров свежей культуры средние почки, последовательно пропитанные водой и разбавленными растворами детергента, становились все более прозрачными в течение 26-часового периода при окончательной перфузии моющим средством, сосудистая сеть почек и, в частности, межлопастные сосуды заметно проявляются в децеллюляризованном каркасе. Весь орган очищается от нативных клеток, оставляя за собой неповрежденную сеть базальной мембраны клубочковых канальцев и собирательных протоков, а также внеклеточный матрикс децеллюляризованных кровеносных сосудов.

В дополнение к более крупным сосудам, микрососудистые базальные мембраны в клубочках также сохраняют свою структурную целостность. Только что было показано, что клетки РСТЭ, посеянные в каркас почки, находятся в основном в корковых областях каркаса почки, где они преимущественно повторно заселяют клубочковые канальцы перега. Немногие клетки встраиваются в клубочки в первый день после посева, а к седьмому дню клубочки практически лишены клеток, в то время как большинство этих клеток занимают корковые области почечного внеклеточного матрикса.

После семи дней антеградного перфузионного культивирования многие канальцы линии RCTE присутствуют в наружных медуллярных и сосочковых канальцах и собирают уток после репопуляции клеток RCTE и одной недели перфузионного посева. Тем не менее, прозрачность, наблюдаемая после децеллюляризации, теряется, и изношенная почка выглядит непрозрачной и ближе по внешнему виду к своему естественному состоянию. После этой процедуры могут быть проведены другие методы, такие как иммунохимический анализ кондиционированных питательных сред, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, как изменяются метаболические или фенотипические состояния этих клеток в почечном внеклеточном матриксе?

Способность разрабатывать внеклеточные каркасы и добавлять обратно донорские продажи в матрикс позволяет исследователям очертить рост и созревание в трех измерениях в пределах естественных каркасов почечного экзоматрикса. Конечная цель состоит в том, чтобы использовать эту технологию в качестве инструмента для лучшего понимания механизмов восстановления и регенерации почек.