Изготовление механически перестраиваемых и биологически активных металлов строительные леса для биомедицинских применений

Общая цель данной процедуры заключается в изготовлении механически настраиваемых и биоактивных металлических каркасов для биомедицинского применения. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области ортопедических имплантатов, такие как возможность создания механически настраиваемого металлического каркаса, способного доставлять лекарственные препараты. Этот метод модификации прост, так как требует только одного параметра контроля.

Данные параметры обеспечивают как механическое усиление, так и устойчивое высвобождение лекарственного вещества, что позволяет создавать функциональные пористые структуры. Сначала смешайте соответствующие количества титанового порошка, кофеина и KD four для изготовления пористых титановых каркасов с четырьмя вариантами начальной пористости в полиэтиленовых флаконах объемом 500 мл. Вращайте флаконы в шаровой мельнице-печи со скоростью 30 RPM при температуре 55 °C в течение 30 минут. Перелейте суспензии из полиэтиленовых флаконов в цилиндрические алюминиевые формы диаметром и высотой 60 мм.

После герметизации каждой алюминиевой формы алюминиевым покровным стеклом поместите формы в печь шаровой мельницы и вращайте их со скоростью 30 RPM при температуре 55 °C в течение 10 минут. Затем снизьте температуру в печи до 44 °C и продолжайте вращать формы со скоростью 30 RPM при 44 °C в течение 12 часов. После охлаждения форм путем вращения при комнатной температуре в течение одного часа извлеките их из печи шаровой мельницы.

Затем извлеките затвердевшую заготовку из титана и кофеина из каждой алюминиевой формы с помощью алюминиевого поршня. После этого поместите затвердевшую заготовку из титана и кофеина в резиновый пакет и полностью запечатайте пакет, завязав его бечевкой.

Поместите резиновый пакет в водяной бак установки для холодного изостатического прессования и приложите изостатическое давление 200 megapascals в течение 10 минут. После извлечения резинового пакета из установки выньте спрессованную «зеленую» заготовку из пакета. Перенесите «зеленую» заготовку из титана и кофеина в тигель Illumina.

Поместите тигель в лиофилизатор и подвергните заготовку лиофильной сушке для сублимации кофеиновой фазы при температуре -40 °C в течение 24 часов. После лиофилизации закройте тигель покровным стеклом Illumina. Поместите закрытый тигель в вакуумную печь при комнатной температуре.

Затем повысьте температуру печи до 1300 °C со скоростью нагрева 5 °C в минуту. Образцы заготовок после воздушной сушки обычно обладают низкой прочностью и могут разрушиться. При обращении с ними следует соблюдать особую осторожность.

После выдерживания при температуре 1300 °C в течение двух часов оставьте центрированный пористый титан в печи на шесть-семь часов до полного остывания печи до комнатной температуры. После извлечения образцов из печи обработайте их на станке для получения более мелких экземпляров и перенесите образцы в стеклянный стакан. Поместите стакан в автоклав и стерилизуйте образцы при температуре 121 °C в течение 15 минут.

По завершении дважды промойте стерилизованные образцы дистиллированной водой и дважды 70% этанолом. Затем поместите пористый титан в чашку Петри и высушите образцы на воздухе при комнатной температуре под воздействием УФ-излучения. На этом этапе разведите зеленый флуоресцентный белок или GFP до концентрации 100 µg/mL, смешав 1 mL белка с 9 mL фосфатно-солевого буферного раствора ECCOs. Поместите пористый титан в стерильную полистирольную пробирку объемом 50 mL и погрузите его в раствор разведенного GFP при комнатной температуре.

Затем немедленно поместите образец в вакуумный эксикатор и откачивайте воздух в течение 10 минут. Чтобы раствор GFP более эффективно проник в поры пористого титана, извлеките стеклянный стакан из эксикатора. Затем с помощью пинцета извлеките пористый титан из стеклянного стакана.

Поместите пористый титан с GFP-покрытием в чашку Петри диаметром 10 сантиметров и высушите на воздухе в течение ночи при комнатной температуре в ламинарном шкафу; на следующий день промойте пористый титан дважды 10 миллилитрами фосфатно-солевого буфера ECCOs в стеклянном стакане. Затем с помощью пинцета поместите пористый титан в чашку Петри диаметром 10 сантиметров и высушите на воздуху в течение ночи при комнатной температуре в ламинарном шкафу. Далее поместите образцы пористого титана с GFP-покрытием различной высоты в цилиндрическую стальную форму и вставьте набор пробойников в верхние и нижние отверстия стальной формы.

Сжатие пористого титана внутри стальной матрицы при комнатной температуре в направлении Z образца. Используйте пресс с промежуточными скоростями деформации от 0,05 до 0,1 с⁻¹ при заранее определенных значениях приложенной деформации. Выдерживайте давление в течение одной минуты.

Извлеките матрицу из пресса. Поместите стальное кольцо на дно корпуса матрицы и верните матрицу в пресс. Перевернув матрицу, медленно прикладывайте давление до тех пор, пока поршень не вытолкнет уплотненные образцы из отверстия D, после чего извлеките матрицу из пресса.

Извлеките уплотненные титановые образцы из стальной формы. В завершение дважды промойте уплотненные образцы в стакане 10 миллилитрами фосфатно-солевого буфера ECCOs и высушите на воздухе в течение ночи при комнатной температуре в стерильном боксе. Структура пор титана, полученная методом традиционного замораживания, демонстрирует направленное выравнивание пор с неправильной формой из-за дендритного роста кофеина.

При замораживании образца методом динамического направленного замораживания образуются почти сферические поры с произвольным распределением; по мере увеличения степени уплотнения форма пор становится приплюснутой, а при максимальном уплотнении поры почти исчезают, так как соседние поры начинают соприкасаться друг с другом. Четыре образца с различной пористостью имели разную начальную высоту до уплотнения и почти одинаковую высоту после уплотнения. Было установлено, что как в образцах с вмятинами, так и в пористом титане наблюдается быстрое высвобождение GFP с начальным эффектом «всплеска», при котором большая часть белка высвобождается в течение одной недели.

Уплотненный пористый титан демонстрирует непрерывное высвобождение в течение одного месяца, при этом GFP отчетливо виден на поверхности даже спустя месяц. Для скаффолда с более плотным ядром внешняя часть была укорочена с помощью механической обработки. Микро-КТ изображение после селективного уплотнения верхней внутренней части показывает внутреннюю и внешнюю части скаффолда с различной пористостью: пористый титан с более высокой внешней и более низкой внутренней частью в результате уплотнения приобретает более плотную внешнюю часть, в которой пористость была снижена по сравнению с внутренней частью, сохранившей начальную пористость после завершения процесса.

При правильном выполнении после этапа разработки данный метод может быть реализован в течение 72 часов. Эта методика открыла исследователям в области биоматериалов путь к изучению возможности изготовления метаструктур с заданными механическими свойствами и лекарственными характеристиками для лечения травм позвоночника. Значение данной техники распространяется на терапию повреждений спинного мозга, поскольку созданный скаффолд может служить искусственным заменителем межпозвоночного диска с функцией доставки лекарственных средств.