Генерация генетически модифицированных культур Органотипической кожи Использование нежизнеспособных Human дермы

Общая цель этой процедуры заключается в создании генетически модифицированных органотипических культур кожи с использованием обновленной дермы человека для определения влияния измененной экспрессии генов на рост и дифференцировку эпидермиса. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области дерматологии, такие как определение того, какие гены отвечают за эпирост, дифференцировку и прогрессирование заболевания. Основное преимущество этой методики заключается в том, что генетически измененная кожа человека создается в течение нескольких дней, что позволяет изучать человеческие образцы, которые потенциально клинически значимы.

Демонстрировать процедуру будет шутливо из моей лаборатории. Если вы получаете замороженную человеческую кожу, поместите ткань в капюшон для культуры тканей на три-пять минут для оттаивания. После размораживания переложите салфетку в стерильную коническую трубку объемом 50 миллилитров или бутылку объемом 125 миллилитров, в зависимости от размера.

Затем добавьте четыре x пенициллин и стрептомицин в один XPBS до тех пор, пока контейнер не заполнится на 75%. Закройте емкость крышкой и энергично встряхивайте в течение пяти минут. Удалите раствор антибиотика и повторите это.

Сделайте шаг еще три раза после последнего мытья, переложите салфетку в новую емкость и добавьте свежий раствор антибиотика. Инкубируйте эту смесь в инкубаторе для тканевых культур при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух недель, чтобы обеспечить отделение дермы от эпидермиса. По прошествии двух недель с помощью щипцов отшелушите эпидермис от дермы.

Отбраковывайте эпидермис в соответствии с протоколом учреждения по работе с тканями человека. Поместите дерму в емкость с раствором антибиотика и промойте энергичным встряхиванием, как и раньше. После последнего промывания переложите дерму в новую емкость с раствором антибиотика и храните при температуре четыре градуса Цельсия до готовности к использованию за день до перефикации семян клеток феникса в готовых средах в шестилуночный планшет с плотностью 800 000 клеток на лунку.

В день трансфекции смешайте шесть микролитров реагента для трансфекции со 100 микролитрами дмм. В течение пяти минут добавьте смесь в пробирку, содержащую три микрограмма ретровирусного вектора для каждой лунки, которую нужно трансфицировать, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут, добавьте всю эту смесь по каплям в каждую лунку клеток феникса и инкубируйте клетки в течение ночи на следующий день после трансфекции. Извлеките среду из клеток феникса и добавьте два миллилитра свежей готовой среды в тот же день.

Ресуспендируйте первичные кератиноциты человека в кератиноцитарной сыворотке свободной среды с антибиотиками и семенами в шесть стеночных планшетов с плотностью 75 000 клеток на лунку. На следующий день соберите среду, которая теперь содержит вирусные частицы из трансфицированных клеток Феникса. Пропустите фильтрующий материал через фильтр 0,45 микрона с помощью шприца, чтобы удалить любые загрязняющие клетки.

Добавьте пять микрограммов на миллилитр гекса-диметилбромида в отфильтрованную среду, содержащую вирусы, чтобы помочь опосредовать процесс заражения. Затем пипеткой ввели два миллилитра вируса на кератиноциты, нанесенные накануне. Затем вращайте шесть настенных пластин в центрифуге при давлении 200 G в течение одного часа при комнатной температуре.

После отжима удалите и выбросьте носитель, содержащий вирус. Промойте клетки один раз одним XPBS, а затем добавьте свежий K-C-S-F-M на следующий день. Заражайте вирусом ту же партию кератиноцитов, используя только что показанную процедуру.

Для изготовления органотипических кассет. С помощью прижигания снимите квадрат размером один сантиметр на один сантиметр с центра крышки чашки для культуры тканей размером 3,5 сантиметра. Прикрепите квадратные колышки к дну кассеты с помощью прозрачного лака для ногтей и дайте лаку высохнуть пять минут.

Наконец, переверните кассету и поместите кассету в шестисантиметровую тарелку так, чтобы кассета лежала на колышках. Извлеките дерму из хранилища четырех градусов Цельсия и перенесите ее в контейнер для роста кератиноцитов. Срединно для стирки.

Повторив промывание, поместите дерму в свежий КГМ и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух дней. После инкубации с помощью скальпеля разрежьте дерму на кусочки размером 1,5 сантиметра на 1,5 сантиметра. Затем помещается на квадратное отверстие органотипическое отверстие верхней частью дермы вверх.

С помощью щипцов переверните всю органотипическую кассету, содержащую дерму. Добавьте пять капель свежего внеклеточного матрикса на дно дермы и слегка встряхните, чтобы обеспечить равномерное распределение по дерме. Дав внеклеточному матриксу застыть в течение пяти минут, с помощью щипцов переверните кассету обратно, а затем добавьте четыре миллилитра КГМ в шестисантиметровую чашку.

Затем, после сбора и подсчета генетически модифицированных кератиноцитов, Resus суспендирует от 0,5 до 1 миллиона клеток в 90 микролитрах КГМ и распределяет клетки на дерму. Инкубируйте сокультуру при температуре 37 градусов Цельсия. Меняйте СМИ о культурах через день.

Полная стратификация и дифференцировка эпидермиса обычно происходит после пятого дня. Ткань можно заготавливать в течение 14 дней после нанесения покрытия. На этом изображении показано окрашивание гематином и эозином органотипических.

Культуры кожи регенерированной кожи человека содержат как эпидермис, так и дерму. Эпидермис полностью стратифицирован и дифференцирован с четырьмя отдельными слоями, включая недифференцированный базальный слой и три дифференцированных слоя, включая слой, шиповидный слой, ранум и рог. Эти иммунофлуоресцентные изображения демонстрируют, что гиперэкспрессия SNA i two, как показано справа, ингибирует эпидермальную дифференцировку по сравнению с контрольной тканью, показанной слева, окрашивающей для дифференцировки.

Белок кератин один или К один обозначен зеленым цветом, а ядра отмечены синим. Анализ RTQ PCR R для измерения уровней мРНК SNAI two в контрольной LAC Z и S NNA I two над экспрессирующей тканью демонстрирует более чем 50-кратную экспрессию SNAI two по сравнению с контролем. Наконец, этот анализ RTQ PCR R показывает, что гиперэкспрессия SNA I 2 приводит к потере экспрессии индуцированных дифференцировкой структурных генов, таких как TGM One и SPRR One A. После этой процедуры следует эта процедура.

Другие методы, такие как чипси, иммунофлюоресценция, RN, ae или вестерн-блоттинг, могут быть выполнены для определения механизмов эпидурального роста и дифференцировки. Этот метод проложил путь исследователям в области дерматологии к изучению того, как функция измененных генов влияет на гомеостаз кожи. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как создавать генетически модифицированные органические культуры кожи человека с использованием кератиноцитов и разрабатывать дерму человека.