Капсульная Инфаркт Описанный Моделирование Использование фототромботического Техника

Общая цель данной методики заключается в создании ограниченной капсулярной модели инфаркта со стойким двигательным нарушением с использованием фототромботической техники. Перед созданием капсулярного инфаркта необходимо идентифицировать область передней конечности во внутренней капсуле путем введения аденоассоциированного вируса, экспрессирующего GFP, в область передней конечности моторной коры. Начните с помещения крысы под наркозом в стереотаксическую рамку.

Затем побрейте голову крысы и простерилизуйте кожу головы, используя 70% спирт и раствор повидона и йода. Введите 2%-ный лидокаина гидрохлорид под кожу головы в область предполагаемого разреза кожи головы для уменьшения боли во время операции. Применяйте офтальмологическую мазь для предотвращения пересыхания глаз.

И наденьте на животное стерильную простыню. После того, как вы сделаете разрез по средней линии в два сантиметра на волосистой части головы, расположите стереотаксическую руку, чтобы определить область передней конечности моторной коры в соответствии со стереотаксическими координатами. Просверлите входное отверстие в этом положении.

Переместите иглу к просверленному отверстию и опустите иглу на один миллиметр через твердую мозговую оболочку и в моторную кору. Используйте высокоточный микронасос для медленного впрыскивания одного микролитра вируса. Оставьте иглу на месте еще на 10 минут, чтобы предотвратить обратный ток вверх по игольчатому тракту.

По прошествии 10 минут медленно извлеките иглу. После очистки операционного места солевым раствором зафиксируйте рану капроновым швом 3-0. Затем освободите крысу от стереотаксической рамки и перенесите ее в камеру восстановления для наблюдения.

Введите анальгетик для контроля послеоперационной боли. Через две-три недели принесите крысу в жертву согласно утвержденным методикам и разрежьте криозащищенный мозг. После окрашивания на GFP наблюдайте за аксонами, трансдуцированными AAV-GFP во внутренней капсуле, с помощью флуоресцентного микроскопа.

Сравните расположение трансдуцированных аксонов, как видно на флуоресцентном изображении, с атласом мозга крысы, чтобы точно определить стереотаксические координаты трансдуцированных аксонов. Чтобы подготовить оптический нейронный интерфейс, сначала с помощью режущего сверла отрежьте примерно четыре сантиметра спинномозговой иглы 27-го калибра со стилетом внутри. Затем зачистите 10 сантиметров оболочки от оптического волокна.

Вставьте кусок оптического волокна без оболочки в металлическую трубку. И зажимаем трубку вокруг волокна. Затем с помощью пресса дважды зажмите нижнюю 1/2 металлической трубки.

Металлическая трубка заполняет пространство между оптическим волокном и ступицей спинномозговой иглы. Нанесите термоотверждаемую эпоксидную смолу на оптическое волокно. Нанесите дополнительную эпоксидную смолу на пустое место в хабе.

И вставьте оптическое волокно в спинномозговую иглу. Отверждайте эпоксидную смолу в течение 20 минут при температуре 100 градусов Цельсия для стабильной фиксации. После отверждения разрежьте оптическое волокно, выступающее из спинномозговой иглы, а затем используйте алмазные притирочные листы для полировки оптического волокна на кончике спинномозговой иглы.

Наконец, подключите соединительную часть патч-корда FCPC к соединителю зеленой лазерной системы. Затем с помощью цифрового измерителя оптической мощности и энергии измерьте интенсивность света от кончика оптического волокна, чтобы обеспечить точное излучение света. Поместите грелку под тело животного, чтобы поддерживать температуру тела на уровне 37,5 градусов по Цельсию.

Начните с обезболивания и подготовки крысы к операции, как и раньше. Сделав разрез по средней линии в два сантиметра, отрегулируйте высоту носового зажима до тех пор, пока брегма и лямбда не выровняются на одном уровне. Правильное выравнивание имеет решающее значение для правильного нацеливания на внутреннюю капсулу.

Расположите стереотаксическую руку так, чтобы определить место фототромбоза. Затем просверлите в этом месте двухмиллиметровое отверстие. Затем отполируйте и очистите наконечник оптического волокна ONI, затем закрепите его на стереотаксической раме, не сгибая.

Проверьте кончик ONI, чтобы убедиться, что он чистый и неповрежденный. Измерьте интенсивность лазера от кончика оптического волокна до введения оптического интерфейса в целевой участок мозга крысы. Отрегулируйте интенсивность лазера до 3,5 милливатт на кончике оптического волокна.

Теперь опустите ONI в целевую область внутренней капсулы, используя дорсовентральную координату, определенную в первом разделе протокола. Затем введите два миллиграмма на килограмм розовой бенгальской розы через хвостовую вену, а затем запустите таймер обратного отсчета, установленный на одну минуту. По истечении минуты включите зеленый лазер с яркостью 532 нанометра на 90 секунд, чтобы создать инфаркт.

После облучения аккуратно удалите ONI из мозга. После очистки места операции зафиксируйте рану нейлоновым швом 3-0. Затем извлеките крысу из стереотаксической рамки и перенесите ее в камеру восстановления.

На этом изображении показана степень поражения инфарктом при различной интенсивности лазерного излучения от двух до пяти милливатт через две недели после фототромботического поражения. Стрелками обозначено поражение инфарктом. Интенсивность оптического света в этой экспериментальной установке составляет от трех до четырех милливатт.

Следующие два изображения показывают микроскопический вид капсулярного инфаркта через три недели после фототромбоза. В этом корональном отделе мозга крысы наконечники стрелок указывают на путь иглы, содержащей оптическое волокно в таламусе и вплоть до внутренней капсулы. Эти серийные окрашенные срезы показывают степень поражения инфарктом во внутренней капсуле.

Стрелками обозначено поражение инфарктом.