Геомагнитное поле (Gmf) и завод Эволюция: Исследуя эффекты ГМП Разворот на

Общая цель данной процедуры — создать инверсию геомагнитного поля (ГМП) с помощью катушек Хольмхольца, управляемых источником питания. В конечном итоге показано, что инверсия ГМП влияет на морфологию и экспрессию генов растений. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области эволюции растений, например, могла ли инверсия магнитного поля Земли сыграть роль в эволюции и адаптации растений.

Основным преимуществом данной методики является возможность тестирования потенциальных биологических эффектов слабых магнитных полей на простой модельной системе, которую можно выращивать в большом количестве повторностей, причем все они находятся в строго контролируемых условиях. Данную процедуру продемонстрируют Альберто Бокко и студент моей лаборатории под его руководством, а также Киара аа, аспирантка моей лаборатории, и Чиа Бертеа, доцент моей группы.

Для начала включите три источника питания постоянного тока, подключенных к трем парам катушек Гельмгольца, и включите трехосевой магнитометр, датчик которого помещен в трехосевые катушки. Включите компьютер и запустите программное обеспечение магнитометра, позволяющее осуществлять сбор данных с трехосевого магнитометра. Источники питания также подключены к компьютеру через интерфейс A-G-P-I-B для управления.

Установите напряжение блоков питания для создания требуемого магнитного поля с реверсированным вектором магнитных полей, как описано в текстовом протоколе. Поместите семена Arabidopsis Aliana экотипа Columbia-0 в пробирку объемом 1,5 мл, предварительно стерилизовав их раствором гипохлорита кальция в течение 10–12 минут при температуре 25–28 °C при постоянном перемешивании. Затем дважды промойте семена 80% этанолом, после чего промойте 100% этанолом.

И, наконец, промывка стерильной дистиллированной водой. До затвердевания приготовьте один литр модифицированной среды Murrah Shiga и SCOG, как описано в текстовом протоколе. Разлейте по 80 миллилитров среды в каждую квадратную чашку Петри, чтобы на одной чашке находилось 30 стерильных семян.

Затем запечатайте планшеты восковой пленкой. Проведите вернализацию планшетов в горизонтальном положении в темноте при температуре 4 °C в течение двух дней для потенцирования и синхронизации прорастания. Подготовьте натриевые лампы, накрыв прожектор синим желатиновым фильтром, чтобы уменьшить красный компонент излучения ламп после вернализации.

Подготовьте чашки Петри для воздействия нормального или инвертированного GMF. Поместите семена в среду с контролируемым климатом при температуре 22 °C в вертикальном положении. Проведите параллельные эксперименты как за пределами трехосевых катушек, так и внутри них.

При режиме фотопериода: восемь часов темноты и 16 часов света. После экспозиции сделайте фотографии чашек Петри для расчета длины корней и площади листьев. Сначала измерьте сторону чашки Петри.

Затем откройте изображение чашки Петри в программном обеспечении Image J и с помощью инструмента «прямая линия» проведите линию, которая точно пересекает край чашки. В меню Analyze выберите Set Scale и введите фактическое расстояние в поле Known Distance. Затем укажите единицу измерения длины.

И, наконец, выберите глобальную опцию, чтобы применить настройки ко всем измерениям длины корня. Тщательно обведите контур корня, используя инструмент «freehand». Измерьте длину, используя функцию «measure» в меню «analyze».

Продолжайте измерять все корни на изображении и сохраните файл для последующего статистического анализа. Для определения площади листа в меню «Image» (Изображение) используйте опцию «Adjust» (Корректировка), затем «Color Threshold» (Цветовой порог), выделите отдельный лист, а в меню «Analyze» (Анализ) выберите «Analyze Particles» (Анализ частиц) и сохраните отдельные измерения для статистического анализа. Отберите отдельно 30 побегов и 30 корней и немедленно заморозьте их в жидком азоте.

Затем измельчите образец в жидком азоте с помощью ступки и пестика, после чего выделите общую РНК согласно текстовому протоколу. Проведите все эксперименты на системе ПЦР в реальном времени с использованием красителя Cyber Green One и ROX в качестве внутреннего стандарта загрузки; реакцию проводите в смеси объемом 25 µL. Используя праймеры, перечисленные в текстовом протоколе, включите контроли без обратной транскрипции для мониторинга контаминации геномной ДНК, а также контроли без матрицы. Снимайте показатели флуоресценции после каждой фазы отжига и элонгации.

Две лупы обозначают собранные данные, включая кривые плавления и диссоциации. Перейдите на экран анализа и настройки и убедитесь, что выбран набор данных, собранный во время сегмента диссоциации эксперимента. Для проведения анализа всех циклов выполните анализ кривой плавления в диапазоне от 55 до 95 °C, включив сегмент диссоциации в тепловой профиль.

Используйте экран кривой диссоциации, доступ к которому осуществляется через вкладку результатов, для просмотра профиля диссоциации. Проанализируйте все графики амплификации с помощью программного обеспечения прибора для ПЦР в реальном времени.

Для получения значений CT откалибруйте и нормализуйте относительные уровни РНК по уровню наиболее подходящих генов домашнего хозяйства. Перейдите к экрану графиков амплификации через вкладку результатов. Используя экран анализа, выбора и настройки, выберите участок подъема (ramp) или плато, данные которого необходимо проанализировать.

Затем выберите вариант «baseline corrected normalized fluorescence» (нормированная флуоресценция с коррекцией базовой линии) в меню флуоресценции на панели управления. Перейдите к экрану значений образцов планшета через вкладку результатов, чтобы отобразить значения CT для выбранных лунок.

Для нормализации результатов ПЦР в реальном времени используйте четыре различных референсных гена. С помощью программного обеспечения для анализа выберите ген с наивысшим рейтингом и используйте наиболее стабильный ген для нормализации. Кратко систематизируйте входные данные в листе Excel, где первый столбец содержит названия генов, а первая строка — названия образцов.

Затем выберите программное обеспечение для анализа в строке меню. В диалоговом окне выберите входные данные. Далее отметьте поля «названия образцов» (sample names), «названия генов» (gene names) и «только простой вывод» (simple output only).

Нажмите кнопку «Go» (Пуск) для выполнения анализа; в качестве наиболее стабильно экспрессируемого гена-кандидата выберите ген с наивысшим рейтингом. После 10 дней воздействия у контрольных растений наблюдается значительно большая длина корня и более развитые листочки по сравнению с растениями, которые подвергались воздействию инвертированного геомагнитного поля (ГМП) в течение 10 дней. Эффектом инверсии ГМП стало резкое изменение экспрессии всех исследованных генов, включая cruciferin 3, copper transport protein 1 и redox responsive transcription factor 1; планки обозначают стандартную ошибку, звездочки указывают на значимые различия между растениями, подвергавшимися воздействию инвертированного и нормального ГМП.

Инверсия GMF не вызвала значимых изменений в экспрессии генов побегов. Однако была отмечена резкая понижающая регуляция экспрессии генов в корнях выращенных растений. В условиях обратного GMF к этим генам относятся thal, aate peroxidase, aate peroxidase, одна железо-содержащая супероксиддисмутаза, один N-A-D-P-H, белок оксидазы респираторного всплеска и catalyst three.

После освоения данной техники время её выполнения может варьироваться от нескольких минут до целого дня, в зависимости от требований конкретного эксперимента, при условии правильного проведения процедуры. После просмотра этого видео у вас должно появиться четкое представление о том, как инвертировать или изменить геомагнитное поле, а также проводить морфологические и генетические исследования подвергнутых воздействию растений. При выполнении данной процедуры важно удалить любые источники магнитного поля из области, окруженной катушками шлема.

Важно, чтобы катушки шлема и их генераторы не создавали тепла или вибраций. Исследователь не должен знать о режиме воздействия магнитного поля до момента записи окончательных данных. Этот метод позволил специалистам по магниторецепции изучить влияние магнитных полей на эволюцию растений, поведение и навигацию животных, а также на клеточные линии человека.

В будущем мы надеемся провести аналогичные исследования в условиях микрогравитации, чтобы оценить, как изменение магнитного поля в космическом пространстве повлияет на рост растений. Работа с системами, создающими слабые магнитные поля, не считается опасной. Тем не менее, следует соблюдать стандартные меры предосторожности и проконсультироваться с квалифицированным электриком перед работой с таким оборудованием, как источники питания для пар катушек в шлеме.