Биолюминесценция изображений из иммунокомпетентных животной модели для глиобластомы

Общая цель данного протокола состоит в том, чтобы продемонстрировать надлежащие методы мониторинга роста опухолевых клеток и внутричерепных опухолей с использованием биолюминесцентной визуализации in vivo для проверки полезности модификации люциферазы опухолевых клеток GL261 мышиного типа. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в изучении иммунологии опухолей и иммунотерапевтического подхода. Например, влияет ли модификация стресса на пролиферацию клеток GL261 и растет ли in vivo.

Основное преимущество данной методики заключается в том, что люциферазная модификация опухолевых клеток GL261 способствует неинвазивному мониторингу их роста и реакции на лечение in situ. Когда культура клеток люциферазы GL261 достигает 70% конфлюенции в колбе T75, соберите клетки путем трипсинизации. Подсчитайте ячейки, а затем перенесите их на 24-луночный планшет с градуирующей плотностью.

После трех часов в инкубаторе для клеточных культур откройте программное обеспечение для биолюминесцентной визуализации и инициализируйте систему визуализации. Когда камера остынет до отрицательных 90 градусов по Цельсию, установите программное обеспечение обработки изображений на люминесцентное освещение с 10-секундной выдержкой и средним биннингом. Затем инкубируйте клетки в 25 микролитрах люциферина на лунку в течение одной минуты при комнатной температуре, и поместите планшет на станцию визуализации.

Выберите Получить, чтобы начать создание образа. Когда изображение будет успешно получено, появится окно изображения и палитра инструментов. Щелкните инструмент «Области интереса» и выберите 6 на 4 на значке разреза.

Закройте область сигнала щелями 6 на 4 и выберите значок карандаша на вкладке Измерения. Появится окно с таблицей измерений области интереса в единицах измерения фотонов в секунду на стерадиан на квадратный сантиметр. Чтобы провести анализ пролиферации in vitro, собирайте клеточные культуры, как показано выше, когда они достигают 70% конфлюенции.

И с помощью многоканальной пипетки поместить опухолевые клетки в 20 лунок в каждой из 96-луночного планшета в соотношении 1,5 умножить на 10 к 3-м клеткам на 80 микролитров среды RPMI на лунку. Чтобы ограничить испарение клеточных культур, заполните окружающие пустые лунки 100 микролитрами свежей среды RPMI. Затем, чтобы оценить клеточную пролиферацию, добавьте по 20 микролитров реагента MTS в каждую лунку клеток.

И инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Через три часа используйте считыватель микропланшетов для измерения поглощения на 490 нанометрах. Чтобы нормализовать значения поглощения, разделите значения за каждый день на соответствующие показания, полученные в первый день.

В день имплантации суспензировать один раз от 10 до 5-х клеток на микролитр в HBSS без кальция и магния из 70%-ной сливающейся культуры опухолевых клеток. Далее, после подтверждения соответствующего уровня седативного воздействия щипцом ноги, побрейте макушку головы каждого подопытного животного. С помощью ватного наконечника очистите каждый череп 2% хлоргексидином.

Затем нанесите смазку на глаза каждой мыши. Теперь с помощью стерильного скальпеля сделайте сагиттальный разрез длиной примерно 1 сантиметр над теменной затылочной костью первого животного. И снова очистите поверхность черепа 3% перекисью водорода, отмечая видимую брегму.

Затем с помощью стерильной иглы 25-го калибра просверлите 3-миллиметровое отверстие в черепе справа от брегмы и сразу за короночным швом. Чтобы обеспечить надлежащую глубину инъекции, с помощью ножниц отрежьте 3 миллиметра от заостренного конца 20-микролитрового наконечника пипетки и вставьте шприц Hamilton 26-го калибра в наконечник до тех пор, пока 3 миллиметра иглы не будут торчать из конца наконечника. Введите иглу в отверстие в черепе и медленно введите 3 микролитра 3 раза по 10 в 5-ю часть опухолевых клеток в течение одной минуты.

Оставьте иглу на месте еще на минуту, а затем медленно извлеките ее. Замените обнаженную кость 3% перекисью водорода и 2% раствором хлоргексидина. Затем, высушив череп с помощью аппликатора со свежей ватной палочкой, вырежьте кусок стерильного костного воска площадью 3 квадратного миллиметра и прикрепите воск к оголенному концу аппликатора с ватным наконечником.

Покройте место инъекции костным воском. Затем с помощью щипцов проведите по воску каждую сторону кожи головы. После закрытия раны и проведения соответствующей послеоперационной анальгезии повторите процедуру для каждого подопытного животного.

Чтобы визуализировать рост внутричерепной опухоли, сначала инициализируйте станцию визуализации, как показано выше. Далее, после подтверждения соответствующего уровня седации путем пощипывания хвоста, настройте параметры системы визуализации, как только что продемонстрировано. За исключением выбора параметра Авто для времени экспозиции.

Когда система визуализации будет готова, поместите мышей на станцию визуализации и выберите «Получить», чтобы получить изображения экспрессии люциферазы. После успешного получения изображения выберите инструмент «Область интереса» на палитре инструментов и «Авто» на значке круга. Обведите области сигнала, чтобы определить области интереса, а затем получить измерения областей в единицах фотонов в секунду, на стерадиан на квадратный сантиметр.

Наконец, удалите мышей из камеры визуализации и наблюдайте за животными с опухолями до тех пор, пока они полностью не выздоровеют. Биолюминесцентная визуализация in vitro клеток GL261, инфицированных лентивирусом, содержащим люциферазу, демонстрирует устойчивую экспрессию люциферазы, аналогичную уровням люциферазы, экспрессируемой линией клеток глиобластомы человека положительного контроля U87MG. Как и ожидалось, неинфицированные клетки GL261 не проявляют фоновой экспрессии люциферазы.

До внутричерепной имплантации не наблюдалось разницы in vitro в скоростях роста GL261-люциферазы и клеточных линий GL261. Как показывает серийная биолюминесцентная визуализация внутричерепных инъекционных опухолей животных, опухолевые клетки GL261, экспрессирующие люциферазу, также демонстрируют быструю и стабильную скорость роста in vivo без существенной разницы в показателях выживаемости между экспериментальными группами, несущими опухоль. После освоения этой техники ее можно использовать для визуализации до 25 мышей в час, если она выполнена правильно.

После своего развития этот метод расширяет возможности биолюминесцентной визуализации для мониторинга роста опухоли GL261 in vivo, способствуя дальнейшему исследованию иммунотерапевтических реакций в иммунокомпетентных моделях мышей.