Эндотелиальных клеток Planar Модель для работы с изображениями иммунологии Synapse Dynamics

Общая цель этого метода заключается в использовании эндотелиальных клеток в качестве нового типа планарной антигенной клеточной модели для исследования фундаментальных антигенных сигнальных процессов. Этот метод может помочь нам решить ключевые вопросы в области адаптивного иммунитета, такие как то, как субклеточная и молекулярная динамика ремоделирования координируется пространственно и временно в пределах иммунологического синапса. Основное преимущество этой методики заключается в том, что эндотелий образует практически плоскую поверхность ЛК.

Это позволяет получать изображения с оптимальным пространственно-временным разрешением в контексте физиологически сложной и формируемой поверхности клетки. Хотя этот метод фокусируется на активации CD 4 положительных TH one эффекторных клеток памяти, он также может быть применен для изучения различных типов антигена и сигнальных процессов типов Т-клеток. Сегодня мы с Крисом покажем вам, как выполнить вторую операцию Begin путем кодирования пересечения первичных клеток легких человека или кожных микрососудистых эндотелиальных клеток мембраной YFP и растворимым DS красным с помощью ядерного поражения NU и наложения трансфицированных клеток на планшеты для визуализации живых клеток.

На следующий день замените среду для культивирования клеток свежей средой с добавлением интерферона гамма, чтобы вызвать экспрессию M MHC two на эндотелиальных клетках, с последующей стимуляцией клеток 20 нанограммами на миллилитр TNF альфа через 24 часа на третий день от 30 до 60 минут. Перед началом эксперимента инкубируйте эндотелий с одним микрограммом на миллилитр, каждый из бактериальных суперантигенов стафилококковым энтеротоксином В и токсическим шоковым токсином по одному при 37 градусах Цельсия. Во время инкубации подсчитайте количество жизнеспособных клеток из интересующей культуры лимфоцитов и перенесите два раза по 10 в шестую часть клеток в коническую трубку объемом 15 миллилитров.

Затем раскрутите клетки и повторно суспендируйте гранулу в двух миллилитрах свежеприготовленного буфера А таким образом, чтобы не осталось клеточных кластеров. Затем добавьте два микромолярных РА два в образец Т-клеток, закройте пробирку крышкой и сразу же переверните ее в однородное положение. Распределите краситель по всей клеточной суспензии.

После 30-минутной инкубации при 37 градусах Цельсия поверните меченые лимфоциты и осторожно, но тщательно восстановите суспендию клеток в 20-40 микролитрах свежего буфера А для получения живого изображения, клетки включают систему микроскопа и открывают соответствующее программное обеспечение для захвата изображений. Установите соответствующие параметры для автоматизированной многоканальной покадровой съемки, а также интервал для сбора данных от 10 до 30 секунд и общую продолжительность примерно от 20 до 60 минут. Далее добавьте свежее масло в цель.

Установите чашку для микроскопа, содержащую 0,5 миллилитра буфера А, на адаптер нагревательного столика и немедленно включите адаптер, ранее установленный на 37 градусов Цельсия. После двух-трех минут равновесия с помощью пипетки объемом 20 микролитров добавьте два загруженных лимфоцита оставшегося РА в камеру для микроскопа и включите визуализацию в светлом поле. Выберите траекторию света к окулярам и с помощью ручки фокуса курса приблизьте объектив к дну чашки микроскопа.

Затем с помощью окуляра и ручки точной фокусировки найдите Т-клетки, расположенные на дне чашки, и с помощью элементов управления XY stage выберите поле, содержащее не менее 10 ячеек, когда соответствующие ячейки будут найдены. Переключение со светлого поля на источник флуоресцентного света и с IP-изображения на ПЗС-камеру. Оптимизируйте параметры съемки, а затем получите снимки Fira 2 3 40 и FIRA 2 3 80.

Одним из ключевых шагов для получения успешных результатов является тщательная оптимизация параметров регистрации флуоресценции, обеспечивающая сбор достаточного количества сигнала, а в случае второй фазы, что базовое соотношение 3 43 80 близко к единице. Когда будет установлено время воздействия FIRA, замените чашку с Т-клетками на чашку для микроскопа с эндотелиальными клетками с помощью одноразовой пипетки для переноса, быстро удалите среду и промойте клетки один раз одним миллилитром предварительно подогретого буфера А, затем замените промывку 0,5 миллилитрами свежего буфера А. С помощью объектива определите поля, в которых ярко флуоресцентные эндотелиальные клетки кажутся здоровыми. Затем отрегулируйте параметры сбора данных для мембраны YFP и DS RED, как только что было продемонстрировано для второй версии.

Следите за тем, чтобы средняя интенсивность флуоресцентного сигнала в каждом канале составляла от 25 до 75% от динамического диапазона детектора. Перед проведением эксперимента по визуализации живых клеток сделайте несколько интервалов изображений эндотелиальных клеток, чтобы установить исходный уровень с помощью автоматизированного программного обеспечения. Затем вводим наконечник небольшого объема в носитель близко к центру объектива.

Медленно дозируйте пять микролитров концентрированной фиры, два загруженных лимфоцита в центр поля визуализации микроскопа. По мере того, как лимфоциты оседают, вносите тонкие корректировки в фокус, чтобы гарантировать, что интерфейсы эндотелиальных клеток Т-клеток сохраняются в фокальной плоскости. При использовании объективов 40 и 63 x оптимальным является от 10 до 20 ячеек на поле.

После требуемого интервала наблюдения продолжайте визуализацию и немедленно пипетируйте CIN непосредственно в чашку для микроскопа до конечной концентрации в два микромоляра, чтобы вызвать максимальную сферу потока кальция. Два сигнала. При применении лечения к клеткам следите за тем, чтобы поддерживать острый фокус на поверхности эндотелия, меченной апикальной мембраной YFP, чтобы обеспечить оптимальное разрешение ремоделирования иммунных синапсов.

При отсутствии суперантигена на эндотелиальном суперантигене, специфичном CD, четыре положительных лимфоцита TH one быстро распространяются, поляризуются и латерально мигрируют по эндотелиальным клеткам. Во время этого процесса лимфоциты распространяют короткоживущие протрузии или ILP на эндотелиальную поверхность, которые проявляются в виде колец мембранной флуоресценции YFP, аналогичной следам в присутствии суперантигена, тесные межклеточные контакты, вызванные ILP, связаны с инициацией потока кальция, что приводит к накоплению стабилизированных ILP в иммунологическом синапсе. Такие матрицы ILP связаны с устойчивой кальциевой сигнализацией.

Кольца мембранной флуоресценции, образующиеся при взаимодействиях эндотелиальных клеток Т-клеток, соответствуют выступам Т-клеток, приводящим к появлению дискретных инвагинационных пятен в эндотелиальных клетках, что подтверждается демонстрацией пространственной и кинетической корреляции этих колец с зонами смещения и исключения цитоплазмы. В течение нескольких минут совместной инкубации эндотелиальных и Т-клеток в присутствии суперантигенной адгезии и сигнальных молекул, связанных с антигенной сигнализацией, коэны обогащаются в отпечатках пота и ILP иммунологического синапса. Действительно, эндотелиальный иммунологический синапс Т-клеток демонстрирует дискретную трехмерную архитектуру, подчеркнутую ILP Т-клеток, простирающимися на поверхность клетки, представляющей антиген, внутри которой обогащен молекулярный механизм распознавания антигена.

С помощью этого подхода можно преодолеть ключевые препятствия в существующих моделях ПК, что позволяет наблюдать за неопределяемой в противном случае 3D-субклеточной архитектурой и быстро ремоделировать физиологические интерфейсы Т-клеток и ПК. Это открывает возможности для новых уровней понимания антигенных сигнальных процессов.