Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Боковые перегородки ядерно и Стриатум конкретных В утробе матери Электропорация в C57BL / 6 мыши

Общая цель этой манипуляции клетками in vivo состоит в том, чтобы специфически модифицировать клетки определенных областей центральной нервной системы мышиной коры, гиппокампа, таламуса, гипоталамуса, латерального септального ядра и стриатума. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся развития и функционирования мозга, например, путем идентификации различных сигнальных каскадов и определения уровня дифференцировки клеток. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет быстро и эффективно манипулировать различными типами клеток центральной нервной системы без трудоемкого создания генетически модифицированных мышей.

В целом, демонстрация этого метода полезна, потому что люди, плохо знакомые с этим методом, часто испытывают трудности с поиском правильного положения электрода, что имеет решающее значение для конкретной электропорации. Чтобы начать эту процедуру, разрежьте скальпелем брюшную полость беременной мыши, находящейся под наркозом. Предотвратите высыхание открытой брюшной полости, смочив ее 0,9%-ным теплым раствором метилового спирта.

Затем осторожно извлеките рога матки с помощью пары кольцевых щипцов. Затем расположите эмбрион Е14 так, чтобы над местом прокола не было видимых сосудов. Чтобы получить лучшую визуализацию, используйте 5-миллиметровый электрод, чтобы определить угол и положение нужной области мозга для трансфекции.

Для внутриутробной электропорации корковой области медленно вводите от 1,5 до двух микролитров раствора ДНК в левый боковой желудочек. И следите за тем, чтобы глубина введения составляла один-два миллиметра, измеренные от стенки матки. Затем, проверьте на сине-зеленую окраску с резким разграничением.

Для лучшей визуализации используйте 5-миллиметровый электрод, чтобы определить угол и положение нужного места в мозге для трансфекции. После этого расположите центр лопаток трехмиллиметрового платинового электрода прямо перед зачатком уха, и убедитесь, что они не расположены над сосудами или плацентой. Впоследствии подайте напряжение, чтобы начать трансфекцию.

Для внутриутробной электропорации формирования гиппокампа введите два микролитра раствора ДНК в правый боковой желудочек эмбриона E15. Затем поместите отрицательный полюс трех-пятимиллиметровых пластинок платинового электрода прямо перед зачатком уха, а положительный полюс - в середине зачатка уха. Затем подайте напряжение, чтобы начать трансфекцию.

Для внутриутробной электропорации ядра латеральной перегородки и стриатума введите один микролитр раствора ДНК в правый боковой желудочек эмбриона E12. Затем поместите 5-миллиметровые электроды на уровне зачатков уха. Впоследствии подайте напряжение, чтобы начать трансфекцию.

Для внутриутробной электропорации таламуса и гипоталамуса введите от одного до 1,5 микролитров раствора ДНК в боковой желудочек эмбриона от E12 до E13. Затем подождите две-три минуты, чтобы раствор диффундировал в третий желудочек. Затем поместите 5 или 3-миллиметровые электроды прямо позади зачатков уха.

После этого подайте напряжение, чтобы начать трансфекцию. На этой схеме показаны соответствующие положения положительного и отрицательного полюсов для трансфекции корковых областей. А этот показывает положение положительного и отрицательного полюсов для трансфекции образований гиппокампа.

Здесь показано положение положительного и отрицательного полюсов для трансфекции стриатума и латерального ядра перегородки. А подходящие положения электродов для трансфекции таламуса и гипоталамуса показаны здесь. Специфика трансфекции зависит от размера электрода.

Увеличение размера лопасти электрода снижает специфичность трансфекции. Это особенно очевидно на ранних эмбриональных стадиях, но также заметно на поздних эмбриональных стадиях. После освоения этой техники ее можно сделать за 15 минут, если она выполнена правильно.

При попытке выполнить эту процедуру важно обращаться с эмбрионами и матерями с большой осторожностью. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как трансфектировать определенные области в центральной нервной системе мыши Black 6.