Простой Альтернатива стереотаксической инъекции для мозга Удельный нокдаун микроРНК

Здесь мы демонстрируем использование проникающего в клетку пептида с модифицированным антисмысловым олигонуклеотидом для специфического подавления микроРНК в мозге мышей. Это было достигнуто за счет разработки антиго против 29 мая. В этом исследовании мы использовали самцов антиго для нацеливания на модификации нуклеиновых кислот, блокирующих микроРНК.

То есть модификации МШУ были заложены на пяти различных позициях. При этом включение модификаций LNA усиливает его аффинность связывания с микроРНК. Кроме того, он придает ядру резистентность и, следовательно, повышает эффективность нацеливания микроРНК.

Комплексы препарата АНТИГО МАР с пептидом готовили in vitro и вводили мышам через хвостовую вену. Нокдаун микроРНК привел к поведенческим изменениям, которые предполагают участие этой микроРНК в атаксии: трех последовательных инъекций было достаточно, чтобы вызвать заметные изменения походки после лечения, была собрана мозговая ткань и подтвержден нокдаун микроРНК. CPP или самопроникающие пептиды в последнее время стали привлекательными носителями для доставки нуклеиновых кислот.

Здесь мы использовали один из таких богатых аргинином нейротропных пептидов, который может подвергаться зарядовому комплексообразованию с МНС, который при введении в системный кровоток достигает назначенного им сайта-мишени, которым в данном случае являются нейрональные клетки, и обеспечивает надлежащее высвобождение МНК в эти клетки. Последовательности членов семейства ME 29 были извлечены из mease, а антисмысловые 16 MER были синтезированы с модификациями нуклеиновых кислот блокировки в пяти равномерно расположенных положениях для получения комплексов. Растворы пептида и антиго соответствующих концентраций готовили отдельно в стерильной 10% глюкозе.

В асептических условиях. Раствор Антиго медленно добавляли по каплям в раствор пептида при осторожном помешивании. Медленное добавление и осторожное перемешивание имеют решающее значение для образования монодисперсных комплексов, размер которых находится в тройном масштабе.

Антиго добавляли каждый раз в трех равных частях, оставляя минуту на смешивание, а затем минуту инкубации без смешивания. Быстрое добавление может привести к агрегации комплексов и выпадению осадков. Теперь комплекс Antigo готов к инъекциям.

Комплекс вводился через инъекцию в хвостовую вену. Мышей вернули в ту же клетку. Поведенческие анализы на атаксию проводились ежедневно, через три часа после инъекции.

Мышь держали за хвост, не позволяя ей касаться каких-либо окружающих предметов. Обратите внимание на то, как задние конечности растопырены в течение 10 секунд. В тесте с уступом мыши должны были ходить по тонкому выступу клетки.

Мыши ходят по тонкому каналу, оставляя отпечатки ног с чернилами на полоске плотной впитывающей бумаги, только задние лапы. Чтобы избежать путаницы в данных с четырех конечностей, давайте посмотрим на Эффект лечения антиго. Мы изолировали мозг и другие ткани от обработанных и контролируемых мышей.

Мы обнаружили, что пептид R VG доставляет флуоресцентно меченую миРНК конкретно в мозг, но не в другие ткани, такие как печень. Ненейротропный контрольный пептид RVM доставил миРНК в печень. У мышей, получавших ANTIER 29, наблюдались дефекты задних конечностей.

Контролируемые мыши, получавшие скремблированный анме, могли преодолевать уступ, но после обработки анме против MARE 29 у мышей наблюдались слабые дефекты в этом анализе. В анализе отпечатка ноги наблюдалось поразительное сокращение длины шага у обработанных мышей. Кроме того, мы подтвердили с помощью QR tpcr, что уровни середины 29 А и середины 29 В были снижены для разработки терапевтических средств на основе микро ННК.

Специфическая для мозга доставка антимикроРНК является проблемой из-за гематоэнцефалического барьера. Используя представленную здесь методику, мы можем избежать традиционного метода доставки антимикроРНК в мозг. Этот метод делает технически возможным нокдаун микроРНК и повышает тканевую специфичность.