Интрацеребровентрикулярное инъекция амилоид-бета пептидов у нормальных мышей с болезнью Альцгеймера Остро индуцируют подобные когнитивные дефициты

Общая цель этой хирургической процедуры заключается в проведении внутримозговой инъекции бета-амилоида без использования стереотаксических инструментов и в остром индуцировании аномалий поведения, подобных Альцгеймеру, у нормальных мышей. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, такие как открытие лекарств от болезни Альцгеймера. Основное преимущество этой методики заключается в том, что мы можем выполнять прямую инъекцию бета-белка в область внутримозгового желудочка мышей без помощи стереотаксических инструментов, что позволяет нам имитировать аномалии поведения, подобные Альцгеймеру, у мышей, не дожидаясь процесса старения.

Применение этого метода распространяется на терапию или диагностику болезни Альцгеймера, поскольку он может быть использован для изучения нисходящей патологии бета-амилоида и скрининга кандидатов в лекарственные препараты. Как правило, люди, не знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что найти точное местоположение брегмы на черепе животного может быть сложно. Чтобы начать эту процедуру, сделайте один миллимоляр А-бета с помощью ДМСО.

Затем разведите его в десять раз в PBS. Затем приготовьте раствор PBS, содержащий 10% ДМСО, в качестве средства для инъекции ICV. После этого оберните микрошприц иглой из нержавеющей стали 26-го калибра с использованием полосок Parafilm для того, чтобы отрегулировать длину иглы для инъекции с контролируемой глубиной.

Плотно оберните шприц несколько раз, чтобы парапленка не сжималась во время введения иглы, а длина иглы оставалась постоянной. Затем разрежьте слои полосок парапленки, чтобы отрегулировать длину иглы до 3,8 миллиметра между кончиком иглы и парапленкой. Далее дважды промойте шприц с 70%-ным этанолом.

Впоследствии промойте шприц дистиллированной водой. Полностью высушите его в вытяжном шкафу не менее 30 минут, а перед инъекцией оставьте чистый шприц под ультрафиолетовым светом еще на 20 минут. На этом этапе поместите семинедельную мышь под наркозом на теплый коврик.

Далее нанесите стерильные капли PBS или мазь на оба глаза, чтобы предотвратить сухость роговицы во время процедуры. После этого подтвердите адекватную анестезию, оценив рефлекс отмены разгибателя пальца ноги. Затем подготовьте два зеркала с несколькими вертикальными линиями, нарисованными на поверхностях, чтобы обеспечить ориентиры для перпендикулярного введения шприца.

Одно зеркало поместите прямо рядом с телом мыши, а другое — перед головой. Держите M1 параллельной воображаемой средней линии между двумя глазами мыши и расположите M2 перпендикулярно M1 так, чтобы две плоскости образовывали угол 90 градусов. Далее распылите 70% этанол на лоб мыши, и разотрите его сухими ватными палочками.

Чтобы определить местоположение брегмы, поместите большой и указательный пальцы прямо над глазами и слегка прижмите лоб вниз до такой степени, чтобы оба глаза выступали. При этом оттяните кожу лба назад, чтобы свести к минимуму движение черепа под ней. Расположите место инъекции с помощью портновской ленты на глубине 2,4 миллиметра под черепом.

Наполните шприц 10 микролитрами раствора А-бета или средства. Расположите шприц так, чтобы он был перпендикулярен плоскости места инъекции. Затем совместите отраженные изображения шприца в обоих зеркалах с нарисованными линиями на зеркалах.

Начинайте вводить иглу до тех пор, пока обертка из парапленки не коснется кожи. Держите шприц одной рукой, а другой рукой вводите пять микролитров раствора А-бета или носителя медленно в течение пяти секунд, не останавливаясь, и следите за тем, чтобы шприц оставался перпендикулярным на всем протяжении. После завершения инъекции подождите от трех до пяти секунд, прежде чем извлекать шприц.

Положите большой и указательный пальцы обратно на голову и удерживайте ее, чтобы предотвратить ненужные движения черепа. Затем извлеките шприц, не наклоняя. Впоследствии поместите мышь на теплый коврик для восстановления.

Чтобы подтвердить, был ли А-бета введен в целевую область ICV, проверьте след введения иглы в ткани мозга, чтобы увидеть, достигла ли она одного из желудочков. Если инъекция не увенчалась успехом, исключите данные этого субъекта из анализа результатов эксперимента. В этом эксперименте полноразмерный А-бета-пептид из 42 аминокислот был использован для получения смеси мономеров А-бета, олигомеров и фибрилл.

На этапе индуцированной HFIP мономеризации были получены относительно однородные мономеры. После семидневной инкубации были разработаны агрегаты А-бета различных размеров, в которых тримеры и тетрамеры были доминирующими видами среди олигомерных форм А-бета. В этом исследовании пространственная рабочая память оценивалась у мышей, которым вводили A-beta в тесте Y-лабиринта, в котором последовательность выбора руки и общее количество входов в руки были записаны, в то время как каждой мыши было позволено свободно исследовать лабиринт.

Группа мышей, получавших инъекцию А-бета, показала значительно более низкие показатели чередования, что указывает на развитие когнитивного дефицита. После освоения этой методики ее можно сделать за 20 минут, включая обезболивающие процедуры, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эти процедуры, важно помнить, что игла должна быть перпендикулярна плоскости инъекции.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области разработки лекарств от болезни Альцгеймера, чтобы изучить in vivo скрининг кандидатов в лекарства на этих легкодоступных моделях грызунов с болезнью Альцгеймера. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить внутримозговожелудочковые инъекции без стереотаксических инструментов.