Воображение нейтрофилов и моноцитов в брыжеечных вен Прижизненное микроскопии на наркотизированных мышей в реальном времени

Общей целью этой процедуры внутрижизненно важной конфокальной микроскопии является мониторинг динамики нейтрофилов и моноцитов в брыжеечных венах в равновесных и воспалительных условиях у мышей. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунологии, например, каковы молекулярные основы миграции лейкоцитов, рекрутирования и взаимодействия с эндотелием сосудов. Основными преимуществами данной методики являются возможность отслеживать и анализировать патрулирование моноцитов с низким уровнем LY 60 в условиях этатистского состояния, а также следить за рекрутированием как моноцитов, так и нейтрофилов в один и тот же сосуд. Простерилизуйте задние лапы восьми-12-недельной мыши с помощью 70% этанола, а затем используйте скальпель для сбора бедренных костей и большеберцовых костей, когда все кости будут отсоединены.

Промойте ноги 90% этанолом и переложите кости в чашку для культивирования, наполненную PBS. Затем в капюшоне с помощью скальпеля очистите бедренные и большеберцовые кости и отделите их в коленном суставе. Затем отрежьте концы костей и используйте одномиллилитровый шприц, изготовленный из подготовительной среды, оснащенной иглой 23 калибра, чтобы промыть костный мозг из каждой кости в коническую трубку объемом 50 миллилитров

Разрушьте клеточные агрегаты, пропустив их обратно через кончик иглы, а затем доведите общий объем клеточной суспензии до 25 миллилитров со свежим препаратом, средними раскрутите клетки вниз, затем восстановите. Подвесьте нёбо в одном миллилитре буфера для лизиса эритроцитов и перенесите клетки в коническую пробирку объемом 15 миллилитров на льду. Через 30 секунд прекратите лизис с 10 миллилитрами препарата. Терпимая.

Снова раскрутите ячейки, и Резус суспендирует гранулу. Еще два миллилитра подготовительной среды для обогащения нейтрофилов путем отрицательного отбора. Сначала инкубируйте клетки костного мозга со 150 микролитрами коктейля для обогащения нейтрофилов мышей на льду в течение 10 минут.

В конце инкубации по 10 миллилитров фенола красного освобождают дмем. Переверните трубку один раз и поверните ячейки вниз. Повторно суспендируйте гранулу в 1,75 миллилитрах подготовительной среды и переложите ячейки в пятимиллилитровую полистирольную трубку с круглым дном.

Затем инкубируйте клетки с 250 микролитрами отборного биотинового коктейля на льду в течение 10 минут. В конце инкубации мы суспендируем магнитные частицы из изоляционного комплекта клеток с 30 секундами вортексинга. Затем инкубируйте клетки с 500 микролитрами частиц на льду в течение 10 минут.

По окончании инкубации поместите трубку в магнит. Через три минуты втяните магнит в новую пятимиллилитровую полистирольную трубку с круглым дном. Чтобы собрать непомеченные клетки, поместите пробирку с непомеченными ячейками в магнит.

Через три минуты переверните магнит в коническую трубку объемом 15 миллилитров, чтобы перенести непомеченные клетки, оставив последнюю каплю в трубке. Затем доведите объем до пяти миллилитров свежим фенолом красным free dm. Теперь добавьте полмикролитра соответствующего цитоплазматического красителя, такого как используемый здесь апельсин для отслеживания клеток, в клетки при температуре 37 градусов Цельсия.

Через две минуты, при температуре 37 градусов Цельсия, промойте клетки 2,5 миллилитрами подготовительной среды и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре подготовительной среды в пробирке объемом 1,5 миллилитра, подсчитайте клетки и затем инкубируйте их в течение пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия. После вращения клеток мы суспендируем гранулу в одном миллилитре PBS с последующим еще одним центрифугированием, пока клетки вращаются. С помощью масла прикрепите стеклянную защитную крышку диаметром 35 мм к 10-сантиметровой чашке для культуры тканей с отверстием диаметром 30 мм.

Затем повторно суспендируйте гранулу в соотношении от 10 до семи клеток на 100 микролитров PBS и поместите клетки на лед как можно скорее после маркировки. Введите меченые нейтрофильные клетки внутривенно в состояние обезболенного CX от 8 до 12 недель CX с тремя CR и одним GFP и поместите мышь на грелку. Затем сразу же нанесите мазь на глаза животного и ножницами вскройте кожу живота, обнажив брюшину, надрезайте ножницами брюшину, чтобы обнажить кишечник.

Затем введите 200 микролитров 37 градусов Цельсия PBS в брюшную полость и переверните мышь лицом вниз над чашкой для культуры тканей, чтобы удалить кишечник из брюшинной полости с легким давлением. Затем с помощью стерильных ватных палочек осторожно наведите кишечник на покровную салфетку, чтобы обнажить брыжеечные сосуды, и обездвижьте ткань кусочками папиросной бумаги, смоченными до 37 градусов Цельсия, чтобы уменьшить движения, возникающие в результате перистальтики. Очень важно не торопиться, чтобы тщательно обездвижить кишечник с помощью отягощенных тканей PBS.

В противном случае движения, возникающие в результате перистальтики во время получения изображения, испортят эксперимент. Затем перенесите чашку для культуры тканей и мышь в термостат с температурой 37 градусов Цельсия на специально изготовленном следовом столике инвертированного микроскопа и введите второй раунд анестетиков внутримышечно на заднюю ногу. Теперь установите соответствующие лазеры на самую низкую необходимую мощность, чтобы избежать фототоксичности, вызванной лазером, и дайте мыши отдохнуть в течение 30 минут.

Когда животное придет в себя, запишите первый видеоролик в течение 30 минут в устойчивом режиме. Затем, чтобы инициировать воспаление кровеносных сосудов, нанесите каплю PBS объемом 20 микролитров, содержащую 100 микрограммов TLR two TLR one агонист PAM three CSK four непосредственно на визуализируемые сосуды. Наконец, приобретите второй фильм, позаботившись о контроле фокуса после добавления агониста, поскольку воспаление вызывает изменения в ширине эндотелия, изменяя фокус оси Z. Здесь показаны различные этапы обработки изображения для первой временной точки фильма, полученного в условиях устойчивого состояния, как только что продемонстрировано.

Патрулирование моноцитов зеленого LASIK cilo в стационарных условиях можно визуализировать с помощью красных нейтрофилов, циркулирующих в кровотоке. Здесь. Та же область интереса проявляется через 90 минут после добавления PAM three CSK four, в результате чего происходит массивное рекрутирование нейтрофилов и моноцитов к эндотелиальной стенке, которые моноциты тщательно сканируют с помощью соответствующего программного обеспечения, точно определяя пути моноцитов и нейтрофилов. Патрулирование эндотелия можно отслеживать до и после начала воспаления.

Важно отметить, что потеря фокуса по оси Z или смещение XY может произойти в результате того, что кишечные движения разрушают эксперимент. Этот метод может быть дополнительно модифицирован путем использования различных генетически модифицированных моделей мышей или введения блокирующих антител или фармацевтических препаратов для определения роли конкретных молекул, представляющих интерес в поведении лейкоцитов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как следить за динамикой насыщения лейкоцитов в брыжеечных венах.