Количественное внутрибрюшинным метастаз рака яичников

Общая цель данного эксперимента заключается в определении относительной опухолевой нагрузки при метастазировании рака яичников внутрибрюшинным путем в модели сингенного ортотопического ксенотрансплантата мыши. Этот новый метод визуализации и количественной оценки относительной опухолевой нагрузки может помочь нам ответить на ключевые вопросы регуляции метастазирования рака яичников. Фундаментальное преимущество этого метода заключается в том, что путем расмешивания флуоресцентных спектров тканевая автофлуоресценция удаляется из изображений, что позволяет измерять стандартизированную, относительную опухолевую нагрузку.

Этот метод дает представление о метастазировании рака яичников человека с последствиями для мониторинга эффективности терапии. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, потому что мы сочетаем надежную технику визуализации с аналитической процедурой для извлечения количественных данных из изображений. Сегодня эту процедуру будет демонстрировать Юэин Лю, руководитель лабораторной программы Stack Lab.

После 10 недель роста опухолевых клеток поместите тело каждой мыши, находящейся под наркозом, в оптическую систему визуализации небольшого животного, по одному. Просканируйте всех мышей в когорте в каждой временной точке. Чтобы наблюдать за флуоресцентно мечеными опухолевыми клетками, выполните мультиспектральную съемку, чтобы собрать в общей сложности пять изображений.

Выберите стандартную экспозицию в 15 секунд, биннинг два на два, поле зрения 16 сантиметров и ступень F 1,1. Затем получите отражательное изображение всего животного с помощью белого света от открытого фильтра возбуждения, открытого фильтра излучения, стандартной экспозиции 0,2 секунды с биннингом два на два и поля зрения 16 сантиметров с диафрагмой 2,8. После эвтаназии используйте острые ножницы для вскрытия, чтобы разрезать кожу спереди вдоль вентральной средней линии мыши, от верхней части бедер до нижней части грудной клетки.

Аккуратно отделите кожу от брюшинной ткани, следя за тем, чтобы не проколоть брюшную стенку. Затем разрежьте сбоку, как по нижней части грудной клетки, так и по верхней части бедер, чтобы создать два лоскута кожи. Поместите мышь на вентральную сторону сканера так, чтобы брюшная полость была обращена вниз, а кожные лоскуты были раскрыты.

Отсканируйте мышь с ее органами на месте, используя те же параметры, которые ранее использовались для живой мыши. Теперь продолжайте препарировать мышь, извлекая печень, сальник, поджелудочную железу, желудок, диафрагму, а также тонкую и толстую кишки с помощью стандартных методов. Кроме того, удалите левую и правую брюшину, яичники, почки, брыжейку и, наконец, жировую подушку.

Наблюдайте, перечисляйте и записывайте каждую из видимых опухолей на органах. С помощью штангенциркуля измерьте диаметр каждой опухоли. Обозначайте опухоли диаметром менее двух миллиметров как маленькие, от двух до пяти миллиметров — как средние и более пяти миллиметров — как большие.

Затем поместите органы на шаблон для сканирования органов, показанный на рисунке 4 прилагаемого текстового протокола, и используйте его для организации расположения каждого органа во время следующего сканирования. Используйте PBS, чтобы поддерживать органы влажными. Отсканируйте каждый лист органов с помощью оптической системы визуализации мелких животных и параметры, которые использовались ранее.

После сканирования поместите органы в 10% формальдегид и обработайте их для гистологии с помощью стандартных методов. Чтобы уменьшить количество автоматической флуоресценции при каждом мультиспектральном сканировании, сначала загрузите спектральный файл красного флуоресцентного белка in vivo, а затем файл auto floor in vivo red в окне несмешанных изображений и выберите un-mix. Затем экспортируйте файлы dot bip в 16-битный немасштабируемый формат dot tif и загрузите их в Image J, перейдя в раздел Файл, откройте и выбрав правильный 16-битный файл dot tif.

Далее заходим в меню изображения, и выбираем настройку, затем контрастность яркости, и устанавливаем минимальное отображаемое значение равным нулю, а максимальное отображаемое значение плюс 35353. Затем снова в меню изображений, перейдите к поиску столов и выберите «Горячо». Для различных животных моделей требуются разные уровни яркости, но важно поддерживать постоянную яркость на протяжении всего исследования.

С помощью инструмента «Выделение свободной руки» нарисуйте область выделения свободной формы вокруг каждого органа. Область интереса свободной формы должна быть проведена близко к границам органа. Затем введите control и M, чтобы использовать инструмент измерения для вычисления площади поверхности каждого органа.

Запишите эти данные в таблицу. С областью интереса, которая была нарисована вокруг каждого органа, щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Дубликат», чтобы включить только орган. Затем под изображением перейдите в раздел Настройка, затем порог и установите нижний пороговый уровень на плюс 1, 200, а верхний пороговый уровень на плюс 1, 700.

Также проверьте темный фон и нажмите OK. При этом будут выделены только наиболее ярко флуоресцирующие области. Для получения изображений может потребоваться ручная работа с ползунками пороговых значений на рисунке J, чтобы выбрать ранее наиболее яркие области для шага анализа, как показано выше.

Различные модели заболевания потребуют разных пороговых ограничений, но важно поддерживать пороговые уровни на протяжении всего конкретного исследования. В разделе Анализ выберите Анализировать частицы и измените размер квадрата пикселя от 10 до бесконечности. Выберите отображение контуров и установите флажок, чтобы выбрать только результаты отображения, а затем нажмите кнопку ОК.

Это позволит измерить как площади, так и исходную интегрированную плотность ярких областей, считающихся опухолями. Запишите значения площади поверхности и исходной интегральной плотности каждой выборки опухоли вместе в одной и той же таблице, содержащей площади поверхности органов. Затем в разделе «Анализ» выберите инструменты и перейдите на панель калибровки.

Добавьте калибровочную масштабную линейку к изображениям органов. Монтажи могут содержать большее или меньшее количество органов в зависимости от конкретного исследования. Далее, под файлом, перейдите в раздел Сохранить как и сохраните монтаж как dot tif и dot jpeg.

Затем откройте файл dot jpeg органов и перейдите в меню вставки, чтобы добавить текстовое поле к каждому изображению. Добавьте метки органов, создав текстовое поле под каждым из трех рядов органов. Откройте каждый из 16-битных точечных файлов сканирования всего тела в Изображение J в порядке номера мыши.

Затем перейдите в меню изображения и выберите «Настроить», а затем «Контраст яркости». Установите минимальное отображаемое значение равным нулю, а максимальное отображаемое значение — плюсом 35353. Далее возвращаемся в меню изображения и ищем таблицы, а затем выбираем горячие докрасна.

Как только это будет завершено, сохраните монтаж в виде файла dot tif и файла dot jpeg. Клеточная линия ID8 мышиного рака яичников, которая вводится мышам за 10 недель до визуализации, флуоресцирует в красном канале и продолжает это делать на протяжении всего роста. Визуализация в реальном времени с помощью оптической системы визуализации мелких животных позволяет наблюдать за расширяющимися клетками ID8 в организме мыши и обеспечивает более точный подход, чем простое взвешивание мыши для оценки опухолевой нагрузки.

После эвтаназии и удаления вентрального слоя кожи неповрежденные органы могут быть рассмотрены более подробно. Тем не менее, отдельные органы, помещенные на шаблон для сканирования органов, четко отображают опухолевую нагрузку в каждом органе. Опухолевая нагрузка в сальнике и поджелудочной железе, яичниках и брыжейке у мыши, показанной слева, намного больше, чем у тех же органов у мыши, показанной справа.

Наблюдение за дифференциальной опухолевой нагрузкой подтверждается количественно как с точки зрения площади опухолевого сервиса, так и интенсивности опухолевого сигнала. После освоения этой техники ее можно использовать для получения изображений до 18 живых мышей в час. Вскрытие и визуализация отдельных органов ex vivo занимает примерно 20 минут на один образец.

После этой процедуры могут быть применены другие методы, такие как количественный магнитный резонанс, чтобы ответить на такие гипотезы, как влияние ожирения на метастазирование рака яичников, как показано в нашей статье об исследовании рака 2015 года.