Идентификация Metal Oxide наночастиц в гистологических образцов Enhanced Темнопольный микроскопии и Гиперспектрального карт

Общей целью этой процедуры является идентификация наночастиц оксида металла в гистологических образцах с помощью микроскопии темного поля и гиперспектрального картирования. Это достигается путем предварительной идентификации интересующей области в положительном контрольном образце, содержащем наночастицы, и получения изображения в темном поле. Вторым шагом является создание гиперспектрального изображения или куба данных интересующей области с помощью гиперспектральной камеры.

Затем создается справочная спектральная библиотека из куба данных положительного управления, которая фильтруется по отрицательному элементу управления для удаления ложных срабатываний. Последним шагом является использование референсной спектральной библиотеки для сопоставления с экспериментальными образцами для идентификации и определения местоположения наночастиц того же состава. В конечном счете, усовершенствованная микроскопия темного поля и гиперспектральное картирование используются для идентификации наночастиц оксида металла в гистологических образцах более быстрым и менее ресурсоемким способом, чем другие методы, такие как электронная микроскопия.

Этот метод имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными методами визуализации и определения характеристик наноматериалов, такими как электронная микроскопия. В этом случае подготовка образцов обычно минимальна и неразрушающая. Получение и анализ изображений менее трудоемки и затратны, и их можно применять для визуализации наночастиц в различных матрицах.

Люди, знакомые с методологией, иногда испытывают трудности, потому что создание соответствующих положительных контрольных образцов и референсных спектральных библиотек является сложной и трудоемкой задачей. Но как только эти начальные шаги будут завершены, экспериментальные образцы могут быть оценены довольно быстро. Хотя этот метод может дать представление о проникновении наночастиц через кожу, он также может быть применен к другим биологическим образцам, таким как бронхоальвеолярный лаваж и мазки крови, а также к небиологическим образцам, таким как фильтры, используемые при оценке профессионального воздействия.

Эту технику будет демонстрировать Плар Соса, студент-медик из моей лаборатории «Начни с подключения и включения источника света», контроллера сцены, оптической камеры, гиперспектральной камеры и компьютерной системы. Затем поднимите столик и конденсатор в рабочее положение и осторожно нанесите три-пять капель иммерсионного масла типа А на линзу конденсора. Если образовались пузырьки, сотрите масло и снова нанесите его на линзу.

Затем поместите образец на предметный столик и медленно поднимайте конденсатор до тех пор, пока иммерсионное масло не соприкоснется с нижней стороной предметного стекла. Это будет заметно по быстро светящемуся кольцу подсветки в местах, где масло соприкасается с предметным стеклом. Установив конденсатор, переключитесь на объектив с 10-кратным увеличением, а затем сфокусируйтесь и выровняйте конденсатор, чтобы максимизировать яркость, при необходимости отрегулируйте ручки выравнивания конденсатора, чтобы центрировать яркое пятно.

Откройте программное обеспечение для оптической визуализации. Сфокусируйте образец с помощью ручки точной фокусировки объектива. Затем найдите интересующий вас регион.

При необходимости отрегулируйте фокус конденсора, чтобы уравновесить освещенность. Нажмите на вкладку настроек в строке меню и нажмите на кнопку захвата изображения. Для захвата события.

Выберите нужный формат изображения и назначьте имя файла для изображения. Кроме того, выберите значение замедленной съемки по умолчанию и, наконец, нажмите OK. Далее перейдите в меню экспозиции и выберите настройки экспозиции, которые создают максимально контрастное изображение.

Здесь уровень установлен на 0,0%Усиление установлено на 2,8 децибела, а выдержка установлена на 56 миллисекунд секунд. Сделайте снимок, нажав кнопку изображения в строке меню. Измените цель на 40 x и 100 x.

При съемке изображений с большим увеличением убедитесь, что световод направлен на гиперспектральную камеру, а затем откройте программное обеспечение для получения данных HSI в программном обеспечении откройте гиперспектральный микроскоп в строке меню и выберите элементы управления микроскопом HSI. Здесь устанавливается увеличение объектива и безопасный путь. Далее измените захват области в настройках, и измените количество линий.

В этом исследовании мы использовали 720 для установки времени воздействия. Здесь мы использовали 0,25 секунды. Оставьте все остальное по умолчанию и нажмите на предварительный просмотр HSI, чтобы просмотреть изображение.

Наблюдайте за результирующим графиком интенсивности, представляющим интенсивность самой высокой длины волны при перемещении пользователя по оси x центра поля камеры. Переместите курсор, чтобы создать точный контур графика. Это приведет к тому, что слева появится числовой индикатор интенсивности.

Сфокусируйте изображение на основе этого предварительного просмотра, отрегулировав тонкую фокусировку объектива, чтобы повысить резкость пиков на этом изображении. Далее оптимизируйте интенсивность света, отрегулировав фокус конденсора яркости источника, или отмените предварительный просмотр и отрегулируйте время экспозиции в программном обеспечении. Нажмите «Захват» и наблюдайте за четырьмя новыми окнами с доступными именами.

Список групп. Зум номер один. Появляются полоса номер один, прокрутка и RGB-полоса номер один.

Разверните окно RGB-канала номер один, так как это куб данных, который будет использоваться для всех будущих ссылок. Правильно? Нажмите на этот куб данных, сохраните его как файл tiff и нажмите OK. Щелкните правой кнопкой мыши в окне изображения куба данных и щелкните левой кнопкой мыши по спектру Z-профиля.

Когда всплывающее окно спектрального профиля появится слева, щелкните по интересующим пикселям на цели куба данных. Самые яркие из них – это те, которые можно с уверенностью идентифицировать как представляющие интересующий материал. В меню анализа частиц выберите инструмент фильтрации частиц для идентификации частиц, присутствующих в кубе данных.

В новом наборе всплывающих окон спектральный максимум должен превышать значение, поэтому он выше пикселей фона, но ниже интересующих материалов. Допустимый максимум данных равен 16 000. В окне инструмента просмотра фильтра частиц нажмите «Выбрать все».

Затем нажмите «Экспорт в спектральную библиотеку» и назначьте имя для вашей спектральной библиотеки. После выбора образца в качестве отрицательного контроля получите несколько кубов данных из образца. При использовании гиперспектральной камеры требуется как минимум одна, но можно захватить и больше.

Для повышения избирательности при открытии куба данных отрицательного контроля нажмите кнопку фильтр спектральной библиотеки В меню анализа, расположенном на главной панели инструментов программы, нажмите кнопку Открыть новый файл и выберите в качестве входного файла спектральную библиотеку, созданную ранее для положительного контроля, нажмите кнопку ОК. В окне спектральной библиотеки фильтра cyto viva. Нажмите на изображение и выберите имя выходного файла для эталонной спектральной библиотеки, а затем нажмите OK.

Затем нажмите на имя файла куба отрицательных контрольных данных в качестве исходного изображения. Программное обеспечение проанализирует спектральную библиотеку и удалит каждый спектр, который соответствует любому спектру куба отрицательных управляющих данных. Получение кубов данных из экспериментальных образцов с открытым кубом экспериментальных данных.

Нажмите на спектральное меню в подменю методов картографирования Открыть картограф спектрального угла. Выберите имя экспериментального куба данных во всплывающем окне и нажмите кнопку ОК. Если имен файлов нет в списке, нажмите кнопку «Открыть новый файл» и выберите куб экспериментальных данных.

Затем нажмите OK во всплывающем окне под названием End Member collection, SAM, нажмите import в строке меню. Затем выберите из файла Spectral Library. Откройте ранее созданную референсную спектральную библиотеку и нажмите OK.

В новом всплывающем окне под названием «Входная спектральная библиотека» нажмите «Выбрать все элементы», нажмите «ОК». Затем кликните правой кнопкой мыши по цвету и выберите. Примените цвета по умолчанию ко всем, нажмите «Выбрать все», а затем «Применить», а затем выберите имя выходного файла и нажмите кнопку «ОК».

Откройте меню наложения в окне куба данных и выберите классификацию. Затем перейдите к имени выходного файла и нажмите OK. В интерактивном меню окна инструментов классов откройте меню опций и выберите объединение классов для создания единой цветовой схемы.

Чтобы упростить анализ данных с помощью другого программного обеспечения, выберите один спектр из списка базовых классов. Затем выберите все классы, кроме неклассифицированных, чтобы объединить их в базу. Затем нажмите OK.

Затем нажмите на выбранный базовый цвет, и все соответствующие спектры будут показаны этим цветом. Чтобы получить аматическое изображение, которое будет показывать совпадающие спектры на черном фоне, нажмите на поле неклассифицированных цветов, которое имеет черный цвет По умолчанию наиболее значительным преимуществом метода является его способность идентифицировать наночастицы оксида металла в гистологических образцах с помощью микроскопии темного поля и гиперспектрального картирования. Эти изображения демонстрируют этот процесс с использованием гистологических образцов кожи.

В то время как некоторые частицы легко заметны в темном поле на оптическом изображении, дополнительные частицы обнаруживаются с помощью гиперспектральной визуализации. Здесь показана ткань кожи свиньи в слое эпидермиса, которая подверглась воздействию наночастиц Illumina. Был обнаружен высококонтрастный кластер наночастиц, отложенный над роговым слоем в дермальном слое, который подвергался воздействию наночастиц диоксида кремния.

Можно увидеть множество высококонтрастных наночастиц, отложенных над соединительной тканью. Наконец, в подкожной клетчатке, которая подвергалась воздействию сирийских наночастиц. Можно увидеть, как множественные высококонтрастные дисперсные наночастицы осаждаются вдоль идентификации наночастиц адипоцитов с помощью этого метода.

В других образцах тканей, таких как легкие, печень, селезенка, почки и лимфатические узлы, возможно. После этой процедуры может быть выполнен анализ изображений, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как количество частиц и их расположение. Некоторые соображения и недостатки, такие как необходимость узкоспециализированного управления и ограничения разрешения фотонных изображений, должны быть сопоставлены с таковыми при использовании традиционных методов.

При выборе наиболее подходящих аналитических методов для изучения конкретных исследовательских вопросов, мы решили продемонстрировать именно это применение, поскольку оно имеет потенциал для дополнения текущих и будущих исследований в области нанотоксикологии. Он также может быть использован в исследованиях в области поглощения, распределения, метаболизма и выведения наночастиц из организма и тканей.