Валидация модели мышей, чтобы сорвать ЛИНК Комплексы в манере соты

Общая цель этого эксперимента состоит в том, чтобы проиллюстрировать полезность трансгенной мышиной модели, позволяющей индуцировать и целенаправленно экспрессировать флуоресцентно помеченный кэш EGFP, два пептида in vivo и, как следствие, разрушение эндогенных комплексов связей. В этом эксперименте экспрессия флуоресцентно меченного кэша 2 будет нацелена на клетки мозжечка Перкина. Этот генетический подход может ответить на ключевые вопросы о роли комплексов связей в позиционировании ядра в различных тканях.

Индуцируемая и целенаправленная экспрессия E-G-F-P-K two имеет ряд преимуществ. Во-первых, для этого требуется единая схема разведения мышей Cay с любым существующим круизным штаммом. Во-вторых, этот подход обходит перинатальность, наблюдаемую в мышиных моделях мутаций зародышевой линии компонентов соединительного комплекса.

Наконец, этот метод позволяет изучить физиологию комплексов звеньев в конкретных клетках или тканях. In vivo. Хлоя Поттер, сотрудник лаборатории, покажет вам различные шаги, необходимые для визуализации E-G-F-P-K двух в мозжечковых G-клетках Буркина.

Для начала разведения мышей clac Z с PCP двух CRE мышей для получения PCP двух CAG C двух мышей, как описано в предыдущих публикациях. Когда полученные детеныши появятся на свет, проведите генотипирование. Чтобы идентифицировать тех, кто содержит трансгены EGFP и Cree, как описано ранее, приготовьте 50 миллилитров 30% раствора сахарозы в PBS и храните его при отрицательных 20 градусах Цельсия до дня забора ткани в соответствующем возрасте, выполните транскардио-перфузию мышей под анестезией, чтобы подготовить мозговую ткань к вскрытию, как описано в письменном протоколе. Поместите расчлененный мозг в 10-сантиметровый планшет для культуры тканей с 10 миллилитрами PBS и отделите мозжечок от мозгового.

Далее с помощью скальпеля рассеките мозжечок в сагиттальной плоскости и перенесите срезы в 30% раствор сахарозы и храните его при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи. Приготовьте кашицу из сухого льда и двух метилбутанов. Дайте температуре ванны выровняться в течение пяти минут.

Затем заполните криоформу составом ОКТ и поместите одну половину рассеченного мозжечка в форму с помощью препарирующего микроскопа и пары щипцов. Расположите мозжечок так, чтобы рассеченная би поверхность, которая находится рядом со средней линией мозжечка, была обращена вверх в форму. Затем перенесите криоформу в сухую глазную суспензию на пять минут, пока соединение ОКТ не образует твердую белую матрицу вокруг образца ткани.

Храните встроенный образец при температуре минус 20 градусов Цельсия до тех пор, пока он не понадобится. Наклейте этикетку на предварительно обработанные полилизиновые стекла для сбора срезов ткани и закрепите блок тканей мозжечка на держателе свежей ОКТ. После того, как блок будет надежно прикреплен, установите держатель для салфеток и сбрейте срезы 40 микрометров, чтобы удалить излишки ОКТ, пока ткань не будет достигнута.

Установите толщину 15 микрометров и соберите срезы, осторожно соприкасаясь с секцией OCT стороной предметного стекла, покрытой полилизином. Храните срезы ткани при температуре минус 20 градусов Цельсия до начала окрашивания и визуализации. Когда будете готовы продолжить, разморозьте отделы мозжечка в темноте, чтобы предотвратить выцветание флуоресцентных белков.

С помощью гидрофобной барьерной ручки нарисуйте прямоугольник по периметру участков ткани. Добавьте в срезы около 500 микролитров 4%-ного параформного альдегида на пять минут, чтобы закрепить ткань. Затем с помощью вакуума отсасывайте фиксатор, особенно стараясь не потревожить участки тканей пипеткой.

Аккуратно нанесите PBS на предметное стекло, не повреждая участки тканей. Через пять минут с помощью вакуумной пипетки осторожно удалите жидкость, повторите полоскание PBS в общей сложности три раза. Далее добавьте в предметные стекла около 500 микролитров блокирующего раствора и выдержите их в течение 10 минут.

Удалите, а затем замените блокирующий раствор тем же раствором, содержащим от одного до 300 разведений либо кал-связывания, либо двух антител к нейзину. Затем удалите раствор антитела и промойте предметные стекла PB S3 раза. Высиживайте предметные стекла в течение одного часа при комнатной температуре в темноте.

Затем приготовьте одно к 1000 разведение анти-US Alexa floor 5 94 для колдовских связывающих меченых слайдов и anti Alexa Fluor 5 94 для Nesprin двух меченых слайдов в блокирующем растворе и храните растворы в темноте до тех пор, пока они не понадобятся. Аккуратно удалите последний PBS, промойте и накройте участки разведенными вторичными антителами на один час в темноте. После инкубации удалите вторичный раствор антител.

Затем нанесите ядерное окрашивание, такое как DPI, на 300 наномоляров в PBS на пять минут. После этого еще дважды промойте срезы в PBS. Удалите как можно больше раствора PBS и покройте участок ткани одной каплей монтажного материала.

Сверху на участок салфетки наденьте стеклянную крышку, избегая попадания пузырьков воздуха, и отставьте на 15-30 минут при комнатной температуре в темноте. Затем используйте флуоресцентный микроскоп для визуализации окрашивания антител и флуоресцентных белков. Для срезов мозжечка используйте объектив 20 x или 40 x.

Чтобы увидеть два ядерных обода E-G-F-P-C, как показано здесь, два E-G-F-P-C можно непосредственно визуализировать в виде срезов мозжечка в канале Фитзи. Кроме того, колокализация EGFP с коровьим связыванием, которое специфически маркирует клетки Перкина, подтверждает, что экспрессия E-G-F-P-C two ограничена клетками перкина внутри клеток Перкина. Второй кэш EGFP нацелен на ядерную оболочку, на что указывают EGFP положительные RIM-подобные паттерны, наблюдаемые вокруг ядра.

В этом примере экспрессия второго кэша EGFP была обнаружена в более чем 70% положительных клеток Перкина, связывающихся с коровами. Второй кэш EGFP вытесняет эндогенный несприн из ядерной оболочки за счет насыщения доступных солнечных доменов. Соответственно, эндогенный NESIN 2 вытесняется из ядерной оболочки клеток Перкина, экспрессирующих EGFP cache two.

В то время как клетки Перкина, которые не экспрессируют E-G-F-P-C два, сохраняют эндогенный незин два в ядерной оболочке в качестве контрольного интерата, которые не экспрессируют CRE-рекомбиназу, демонстрируют NESIN 2 в ядерной оболочке всей популяции клеток бикини One. Таким образом, доступны КТ-блоки тканей. E-G-F-P-K два можно визуализировать примерно за четыре часа.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что степень фиксации PFF и/или условия встраивания могут кардинально повлиять на антигенность вашего эпитопа. Поэтому очень важно определить оптимальные условия фиксации, которые сохранят ваш конкретный эпитоп. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как использовать модель CK two transgenic мышей для нацеливания экспрессии VGFP кешью на определенные ткани.