Подготовка и Фотоакустическая Анализ клеточных транспортных средств, содержащих Gold наностержней

Общая цель этого протокола заключается в использовании клеточных транспортных средств, содержащих золотые наностержни, в качестве инновационной стратегии доставки плазмонных частиц в опухоли. Наш протокол может помочь ответить на ключевые вопросы по развитию фотоакустических и фототермических подходов к визуализации и лечению рака с использованием экзогенных контрастных веществ. Этот метод основан на тропизме опухолеассоциированных микрофагов для доставки плазмонных частиц к опухолям.

Идея состоит в том, чтобы изолировать эти клетки от пациента, загрузить их плазмонными частицами in vitro, а затем ввести их обратно в хозяина с намерением использовать их в качестве хозяев эстрогена. Одним из преимуществ этого подхода является возможность получения большего контроля над оптической и биохимической стабильностью частиц, поскольку их биологический интерфейс полностью сконструирован in vitro. Для начала очистите шесть миллилитров золотых наностержней с цетримониевым покрытием при концентрации золота 450 микромоляр с помощью двух центрифугирований, после чего сцеживайте и промывайте в 500 микромолярах водную воду бромида цетримония.

Затем добавьте 1,5 миллилитра 100 миллимоларного ацетатного буфера с бромом цетримония и полисорбатом 20 в сосуд, содержащий гранулу золотой частицы. Затем добавьте 7,5 микролитров 10 миллимолярных альфа-метокси-омега-меркаптополиэтиленгликоля в воду и оставьте на 30 минут для реакции при температуре 37 градусов Цельсия. Далее добавьте 7,5 микролитров 100 миллимолярного меркаптоундецилтриметиламмония бромида в диметилсульфоксид

Затем дайте реакции отдохнуть в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия. Через 24 часа добавьте в воду 4,5 миллилитра 0,005%полисорбата 20. Теперь, используя этот мягкий раствор полисорбата 20, очистите частицы с помощью четырех циклов центрифугирования и декантации.

Наконец, перенесите частицы в 600 микролитров стерильного фосфатно-солевого буфера. Номинальная концентрация золота теперь должна составлять 4,5 миллимолара. Чтобы подготовить клетки, выложите две 60-миллиметровые чашки с полумиллионом моноцитарных макрофагических клеток в модифицированной среде Dulbecco Modified Eagle Medium и выращивайте их в течение 24 часов.

Через 24 часа замените клеточную среду свежей средой, дополненной приготовленными катионными наностержнями золота для конечной концентрации 100 микромолярного золота и раствором в каждой чашке Петри. Затем продолжайте инкубацию еще 24 часа. На следующий день проверьте клетки под микроскопом.

Они должны иметь нормальную морфологию и множество темных внутриклеточных пузырьков. Если клетки выглядят хорошо, промойте их свежей средой, отделите скребком и объедините клетки из двух чашек, чтобы в одной коллекции было не менее двух миллионов клеток. Теперь центрифугируйте коллекции при давлении 120 G в течение 6 минут, чтобы удалить избыток катионных золотых наностержней.

Откажитесь от надлежащих элементов. Клеточные гранулы должны выглядеть почти черными. Суспендируйте гранулы в двух миллилитрах фосфатно-солевого буфера и подсчитайте клетки с помощью камеры Нейбауэра.

Затем смешайте суспензии, содержащие два миллиона клеток, и вращайте их при 120 G в течение шести минут. Доведите гранулы до двух миллилитров 3,6% формальдегида и фосфатно-солевого буфера и дайте клеткам закрепиться в течение 10 минут при комнатной температуре. Наконец, удалите фиксатор с помощью трех промывок, буферизованных фосфатами.

За день до начала этой процедуры приготовьте 500 микролитров подкисленного 3%-ного по объему низкомолекулярного раствора хитозана. Добейтесь pH 4,5 за счет добавления уксусной кислоты. Чтобы тщательно перемешать раствор, дайте ему гомогенизироваться в течение 24 часов при температуре 40 градусов Цельсия.

На следующий день смешайте мышиные макрофаги, приготовленные с золотыми наностержнями, со всеми 500 микролитрами раствора хитозана. Для того, чтобы получить фантомы толщиной 50 микрон, загрузите 250 миллиграммов смеси в формы из полистирола площадью 1,9 квадратного сантиметра. Дайте образцам отдохнуть под капотом в течение 24 часов.

На следующий день обработайте образцы 500 микролитрами 1 моляра водного гидроксида натрия, чтобы вызвать сшивку, и промойте их 10 миллилитрами ультрачистой воды. Проанализируйте стабильность фотоакустического преобразования с помощью специализированного фотоакустического микроскопа, который оснащен оптическим параметрическим генератором, аттенюатором для настройки оптического флюенса и ультразвуковым преобразователем. Начните с суспензии пленки хитозана, содержащей макрофаги, в деионизированной воде с помощью пластикового держателя, погруженного в резервуар для воды.

Определите флюенс зонда, который не повреждает образец и передает фотоакустическую эмиссию с достаточным соотношением сигнал/шум. Настройка пробного флюенса и параметров сбора. Для каждого импульса от лазера получите соответствующий фотоакустический сигнал от ультразвукового преобразователя.

Рассчитайте отношение интенсивности фотоакустики к флюенсу лазера для каждого импульса. Анализируйте его тренд в зависимости от числа импульсов и проверяйте его стабильность с течением времени. В случае нестабильности повторите это измерение с меньшим пробным флюенсом.

В случае стабильности пробный флюенс может быть использован в качестве зондового флюенса при условии, что его фотоакустическая эмиссия демонстрирует подходящее отношение сигнал/шум. Затем измерьте флюенс порога изменения формы. Выберите случайную точку образца, установите лазер на флюенс зонда и измерьте среднюю интенсивность фотоакустики, А, в течение 500 импульсов.

Затем увеличьте номинальное флюенс над флюенсом зонда и подайте 50 импульсов. Назовите их среднее флюенс как возбуждение F. Сбросьте лазер на флюенс зонда и повторите измерение, взяв среднюю интенсивность фотоакустики, В, за 500 импульсов.

Теперь рассчитайте отношение R от B к A. Значение An R ниже единицы указывает на необратимое изменение оптических свойств образца. Затем с помощью микрометрического столика переместите пленку, чтобы случайным образом изменить точку измерения образца. Затем повторите измерение R для различных значений возбуждения F, чтобы взять несколько значений R вокруг и ниже единицы.

Около 15 R-баллов — это разумный набор данных. Затем построите график R как функцию возбуждения F и определите порог изменения как флюенцию, когда R отклоняется от единицы без неопределенности. Как правило, катионные наностержни золота претерпевают массовое накопление в макрофагах, которые сохраняют свою нормальную морфологию.

Обнаружено, что частицы заключены в плотных эндоцитарных везикулах. На более поздних этапах процесса включение в гидрогель хитозана, по-видимому, не влияет на клеточную морфологию. Клетки хорошо распределены по всему образцу, что видно с помощью микрофотографии.

Контроль пленок хитозана, содержащих золотые наностержни без клеток, является гомогенным. Плазмонные полосы золотых наностержней сохраняются в их клеточных носителях. Такие эффекты, как плазмонное взаимодействие или различное поглощение частиц с разным размером и формой, не играли существенной роли в этих протоколах.

После сбора данных тренд R как функция возбуждения F дает представление о данных и анализе, необходимом для определения порога F. Здесь было обнаружено, что порог F составляет около 11 миллиджоулей на квадратный сантиметр. Фотоакустические измерения были высокоточными с отношением сигнал/шум более 20 на 500 импульсов.

Наш протокол является инновационным по отношению к существующим методам проектирования частиц и исследования их фотостабильности. Модификация пегилированных золотых наностержней четвертичными катионами аммония обеспечивает высокую эффективность поглощения клетками при сохранении коллоидной стабильности. Измерение стабильности фотоакустического преобразования путем определения порога изменения является количественным и воспроизводимым.

Поскольку эти частицы предназначены в качестве контрастных веществ для фотоакустической визуализации, фотоакустический зонд идеально подходит для проверки их функциональных свойств. Клеточные носители плазмонных частиц видны в качестве контрастных веществ для фотоакустической визуализации. Их фотостабильность такая же, как у свободных плазмонных частиц.

В настоящее время основное внимание в нашей работе уделяется физиологии этих клеток, при этом особое внимание уделяется их жизнеспособности и хемотаксической активности.