Оценка метастазов в легких у мыши опухоли молочной Модели количественными ПЦР в реальном времени

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы определить количество специфической мРНК из опухолевых клеток в легком в качестве метода анализа метастазов. Основное преимущество данной методики заключается в том, что она является количественной мерой метастазирования. Чтобы провести вскрытие опухоли легких, после усыпления мыши с использованием смертельной дозы изофтора в соответствии с текстовым протоколом, поместите мышь на поролоновую доску на спине с расставленными конечностями и закрепите ее на доске с помощью рассекающих штифтов.

После использования этанола для опрыскивания мыши, с помощью щипцов захватите нижнюю часть животного в центре, а ножницами разрежьте вверх по направлению к шее через кожу, стараясь не проколоть брюшную полость мыши. Теперь возьмитесь за брюшину в нижней части тела животного и начните резать вверх к основанию шеи. Осторожно разрежьте вдоль левой и правой сторон грудной клетки, стараясь не перерезать кровеносные сосуды, которые могут кровоточить в грудную полость.

Удалите реберные кости, разрезая влево и вправо, через диафрагму и верхнюю часть грудной клетки. Затем с помощью щипцов захватите трахею мыши и потяните вперед, а затем с помощью ножниц для рассечения трахеи перед удалением легких у мыши. Используйте PBS для бережного промывания легочной ткани.

Затем, после грубой оценки легочной ткани в соответствии с текстовым протоколом, если необходимо немедленно проанализировать легкие, приступают к выделению РНК. Чтобы выделить РНК из ткани, начните с гомогенизации ткани с помощью одного из методов, перечисленных в текстовом протоколе. Приготовьте буфер для лизиса из набора для выделения РНК и добавьте 20 микролитров опухолевого каптоэтанола в каждый миллилитр буфера для лизиса.

Ресуспендируйте каждые 30 грамм ткани в 300 микролитрах буфера для лизиса и с помощью ультразвукового аппарата, установленного на амплитуду 30%, обрабатывайте ткань ультразвуком в течение 10 секунд. Добавьте 10 микролитров протиназы К к 590 микролитрам TE-буфера, и добавьте 600 микролитров буфера к 300 микролитрам обработанной ультразвуком ткани. Выдерживать при комнатной температуре в течение 10 минут.

Затем центрифугируйте образцы при давлении, большем или равном 13 000 G в течение 10 минут, чтобы удалить мусор. Затем переложите надосадочную жидкость в новые пробирки. Добавьте 450 микролитров этанола на каждые 900 микролитров надосадочной жидкости, чтобы осадить РНК.

Затем перенесите 700 микролитров смеси лизатэтанола в колонку РНК. Вращайте снова со скоростью, равной или равной 13 000 G в течение одной минуты, чтобы связать РНК со столбиком. Затем выбросьте жидкие отходы, добавьте оставшуюся надосадочную жидкость в колонку, и снова вращайте.

Далее добавьте 350 микролитров промывочного буфера один в верхнюю часть колонки и центрифугируйте образцы в течение 30 секунд. Выбросьте жидкие отходы и установите колонку в трубку. Приготовьте ДНКазу, смешав пять единиц ДНКазы с одним ферментом с пятью микролитрами 10-кратного буфера ДНКазы и 40 микролитрами воды, свободной от ДНКазы РНКазы для каждого образца.

Добавьте по 50 микролитров смеси ДНКазы в каждую колонку, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем добавьте 350 микролитров промывочного буфера в колонки и центрифугируйте образцы в течение 30 секунд. Выбросив отработанный раствор, добавьте 600 микролитров буфера для стирки два, и отжимайте еще 30 секунд.

Выбросьте жидкость перед добавлением 250 микролитров в буфер для стирки, а затем отверните в течение двух минут. Переложите колонку в новую пробирку для сбора и добавьте в колонку от 50 до 100 микролитров воды, свободной от РНКазы ДНКазы. После инкубации в течение одной минуты вращайтесь в течение одной минуты.

Повторно пропустите собранный элюат через колонку, чтобы увеличить выход РНК. Для немедленного использования держите образцы на льду. Для последующего использования заморозьте на сухом льду или жидком азоте и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия до тех пор, пока это не понадобится.

С помощью спектрофотометра количественно определите РНК. Затем в стерильных ДНКазных ДНКазных ПЦР-пробирках или планшетах используйте от 0,5 до 2 мкг общей РНК для приготовления реакционной смеси для первого транссинтеза, как показано в этой таблице. Перемешайте, аккуратно центрифугируйте и запрограммируйте стандартную ПЦР-машину с помощью показанной здесь программы.

Когда реакция будет завершена, используйте стерильную воду, не содержащую нуклеазы, чтобы разбавить готовую реакцию до нужного объема. Для проведения ПЦР в реальном времени используйте положительную контрольную ДНК С, такую как HER2 человека, чтобы установить стандартную кривую для каждого набора праймеров путем подготовки от одного до четырех серийных разведений ДНК С для получения пяти стандартов. Далее подсчитайте количество общих образцов, в которые должны входить стандартная кривая и экспериментальные выборки.

Затем в стерильных свободных пробирках ДНКазы РНКазы приготовьте мастер-смесь для каждого интересующего экспериментального гена, а также внутренний контроль, такой как gapdh. Подготовьте тестовую пластину, содержащую один микролитр С-ДНКазы, для каждого стандартного или экспериментального образца. Выделите по крайней мере один образец ДНК C в лунку для каждого праймерного зонда.

Добавьте 19 микролитров mastermix на лунку для каждого праймерного щупа. Этот эксперимент с биолюминесценцией показывает, что легкие мышей, обработанные ACT1, который нацелен на белок щелевого соединения Connexin 43, оказались отрицательными на активность люциферазы, что свидетельствует об отсутствии опухолевых клеток в ткани. Тем не менее, анализ срезов H&E легочной ткани показывает микрометастазы, которые не были освещены люциферазой, что позволяет предположить, что визуализация люциферазы недостаточно чувствительна для обнаружения небольшого количества опухолевых клеток.

Здесь представлены результаты эксперимента qRT-PCR с использованием зонда, специфичного для HER2, для обнаружения опухолевых клеток человека HER2 плюс JIMT1 в легочной ткани из клеток, первоначально трансплантированных в жировую подушку памяти мыши. Несмотря на то, что ни в одном из легких не было обнаружено заметных метастазов, в двух из 11 образцов методом qRT-PCR были обнаружены метастазы. На этом рисунке был подготовлен стандартный анализ кривой для определения относительных уровней HER2, нормализованных к gapdh в легких мыши в ряду номеров.

Результаты показывают, что qRT-PCR с использованием зонда HER2 была достаточно чувствительной, чтобы обнаружить уровни HER2 всего в 10 клетках. Наконец, этот регрессионный анализ показывает относительное количество клеток в каждом образце легких, включая положительный и отрицательный контроль. После освоения этой техники ее можно выполнить за шесть-восемь часов, если она выполнена правильно.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о мерах предосторожности для поддержания целостности РНК во время выделения РНК и обратной транскриптазной реакции. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как обнаружить метастазы во всей легочной ткани с помощью количественной ПЦР в реальном времени.