Оценка метастазов в легких у мыши опухоли молочной Модели количественными ПЦР в реальном времени

Общая цель данной процедуры — определить количество специфической мРНК из опухолевых клеток легкого в качестве метода анализа метастазирования. Основным преимуществом данной методики является то, что она обеспечивает количественную оценку метастазов. Для проведения диссекции опухоли легкого после эвтаназии мыши с использованием летальной дозы изофлурана согласно текстовому протоколу поместите мышь на пенопластовую доску на спину с разведенными конечностями и зафиксируйте её на доске с помощью диссекционных булавок.

После обработки мыши распылителем с этанолом с помощью пинцета захватите нижнюю часть тела животного по центру и ножницами сделайте разрез кожи вверх по направлению к шее, стараясь не проколоть брюшную полость мыши. Затем захватите брюшину в нижней части тела животного и начните резать вверх к основанию шеи. Осторожно сделайте разрезы вдоль левой и правой сторон грудной клетки, стараясь не повредить кровеносные сосуды, что может привести к кровотечению в грудную полость.

Удалите ребра, сделав разрезы слева и справа через диафрагму и верхние отделы грудной клетки. Затем с помощью пинцета захватите трахею мыши и потяните ее вперед, после чего диссекционными ножницами перережьте трахею и извлеките легкие из организма мыши. Осторожно промойте легочную ткань с помощью PBS.

Затем, после макроскопической оценки легочной ткани согласно текстовому протоколу, если легкие подлежат немедленному анализу, переходите к выделению РНК. Для выделения РНК из ткани начните с гомогенизации ткани одним из методов, перечисленных в текстовом протоколе. Приготовьте лизирующий буфер из набора для выделения РНК и добавьте 20 µL каптоэтанола для опухолей на каждый миллилитр лизирующего буфера.

Ресуспендируйте каждые 30 г ткани в 300 µL лизирующего буфера и обработайте ткань ультразвуком в течение 10 секунд, используя соникатор с амплитудой 30%. Добавьте 10 µL протеиназы K к 590 µL буфера TE, затем добавьте 600 µL полученного буфера к 300 µL соникатированной ткани. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут.

Затем центрифугируйте образцы при ускорении не менее 13,000 ×g в течение 10 минут для удаления клеточного дебриса. Перенесите супернатант в новые пробирки. Добавьте 450 µL этанола на каждые 900 µL супернатанта для осаждения РНК.

Затем перенесите 700 µL смеси лизата с этанолом в колонку для выделения РНК. Снова центрифугируйте при ускорении не менее 13,000 ×g в течение одной минуты для связывания РНК с сорбентом колонки. Затем слейте жидкость из сборника, перенесите оставшийся супернатант в колонку и повторно центрифугируйте.

Затем добавьте 350 мкл промывочного буфера 1 в верхнюю часть колонки и центрифугируйте образцы в течение 30 секунд. Слейте жидкость и верните колонку в пробирку. Приготовьте DNase, смешав 5 ед. фермента DNase 1 с 5 мкл 10X буфера для DNase и 40 мкл воды, свободной от DNase и RNase, для каждого образца.

Добавьте 50 µL смеси DNase в каждую колонку и инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем добавьте в колонки 350 µL промывочного буфера один и центрифугируйте образцы в течение 30 секунд. После слива отработанного раствора добавьте 600 µL промывочного буфера два и центрифугируйте еще 30 секунд.

Слейте жидкость перед добавлением 250 µL промывочного буфера 2, затем центрифугируйте в течение двух минут. Перенесите колонку в новую пробирку для сбора и добавьте в колонку от 50 до 100 µL воды, свободной от RNase и DNase. После инкубации в течение одной минуты центрифугируйте в течение одной минуты.

Для увеличения выхода РНК повторно пропустите собранный элюат через колонку. Для немедленного использования храните образцы на льду. Для последующего использования подвергните их мгновенной заморозке на сухом льду или в жидком азоте и храните при температуре -80 °C до востребования.

С помощью спектрофотометра определите количество РНК. Затем в стерильных ПЦР-пробирках или планшетах, свободных от РНказ и ДНказ, используйте от 0.5 до 2 мкг общей РНК для приготовления реакционной смеси для первого трансинтеза, как показано в этой таблице. Перемешайте, осторожно центрифугируйте и настройте стандартный ПЦР-амплификатор согласно программе, приведенной здесь.

По завершении реакции используйте стерильную воду, не содержащую нуклеаз, чтобы довести конечный объем реакционной смеси до нужного значения. Для проведения ПЦР в реальном времени используйте положительный контроль кДНК, например, HER2 человека, для построения стандартной кривой для каждого набора праймеров, подготовив от одного до четырех последовательных разведений кДНК для получения пяти стандартных образцов. Затем рассчитайте общее количество образцов, которое должно включать образцы для стандартной кривой и экспериментальные образцы.

Затем в стерильных пробирках, свободных от РНказ и ДНказ, приготовьте мастер-микс для каждого исследуемого гена, а также для внутреннего контроля, например, gapdh. Подготовьте тестовую планшетку, содержащую 1 µL кДНК для каждого стандартного или экспериментального образца. Разместите как минимум один образец кДНК в каждой лунке для каждого праймера-зонда.

Добавьте по 19 µL мастер-микса в каждую лунку для каждого праймер-зонда. Данный эксперимент по биолюминесценции демонстрирует, что легкие мышей, обработанные ACT1, который нацелен на белок щелевых контактов Connexin 43, оказываются отрицательными по люциферазной активности, что предполагает отсутствие опухолевых клеток в ткани. Однако анализ срезов легочной ткани, окрашенных гематоксилином и эозином (H&E), выявляет микрометастазы, которые не были визуализированы с помощью люциферазы, что указывает на недостаточную чувствительность люциферазного имиджинга для обнаружения небольшого количества опухолевых клеток.

Здесь представлены результаты эксперимента qRT-PCR с использованием зонда, специфичного для HER2, для обнаружения опухолевых клеток JIMT1, экспрессирующих человеческий HER2, в тканях легких после первоначальной трансплантации клеток в жировую подушку памяти мыши. Несмотря на то, что макроскопических метастазов в легких не наблюдалось, в двух из 11 образцов методом qRT-PCR были обнаружены метастазы. На данном рисунке представлен анализ стандартной кривой, подготовленный для определения относительных уровней HER2, нормализованных по уровню gapdh легких мыши в серии с различным количеством клеток.

Результаты показывают, что метод qRT-PCR с использованием зонда к HER2 обладает достаточной чувствительностью для определения уровней HER2 даже в 10 клетках. Наконец, данный регрессионный анализ демонстрирует относительное количество клеток в каждом образце легкого, включая положительный и отрицательный контроли. После освоения эта методика может быть выполнена за шесть-восемь часов при условии соблюдения всех правил протокола.

При выполнении данной процедуры важно соблюдать осторожность для сохранения целостности РНК во время её выделения и реакции обратной транскрипции. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как определять метастазы в цельной ткани легкого с помощью количественной ПЦР в реальном времени.