Флуоресценции и Биолюминесценция изображений субклеточных Ca ²⁺ У пожилых нейронов гиппокампа

Общая цель этой процедуры заключается в исследовании ремоделирования кальция в стареющем мозге с использованием флуоресцентной и биолюминесцентной визуализации цитозольного и митохондриального кальция в долговременных культурах нейронов гиппокампа братства, что рассматривается в качестве модели старения нейронов. Этот метод может помочь понять ключевые вопросы в области старения, такие как ремоделирование внутриклеточного кальция способствует эксайтотоксичности и повреждению нейронов, которые связаны с перегрузкой кальцием. Основное преимущество этого метода заключается в том, что можно внимательно следить за ремоделированием кальция в отдельных нейронах с использованием культур при различных DYS in vitro из одного и того же образца, дупликации этого метода через или терапию инсульта или клеточного заболевания, потому что он изменяет новую мишень, связанную с перегрузкой кальцием при этом агенте, связанном с заболеваниями.

После просмотра этого видео Иисус получил хорошее представление о том, как проводить флуоресцентную и реминисценциальную визуализацию цитозольного и митохондриального кальция в краткосрочных и долгосрочных культурах нейронов гиппокампа крыс. Для начала этой процедуры распределите покровные листы на полоске параформы в чашке Петри. Затем нанесите 200 микролитров поли Д лицина из расчета один миллиграмм на миллилитр на каждую покровную накладную и обработайте на ночь.

На следующий день промывайте чехлы стерильной водой двойной дистилляции каждые 15 минут в течение 90 минут в стерильных условиях. Поместите крышки в мультибокс и храните их во влажном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 до использования. Чтобы изолировать нейроны гиппокампа, вскройте череп новорожденных крыс стерильными ножницами, извлеките мозг с помощью шпателя и быстро промойте его в среде ветчины F 12.

Затем сделайте диагональный надрез скальпелем в каждой полусфере и перенесите его в чашку Петри, содержащую окорок F 12 среды под микроскопом. Выбросьте мозговые оболочки. Тщательно определите гиппокамп в характерном вогнутом месте над корой головного мозга.

Затем отделите гиппокамп от коры головного мозга, осторожно оттянув его в сторону и удалив с помощью глазных ножниц. Далее переложите кусочки гиппокампа во флакон, содержащий 1,8 миллилитра предварительно отфильтрованного раствора пепана. Инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия, время от времени слегка встряхивая в течение 15 минут.

Затем добавьте 90 микролитров ДНК в один раствор. Добавьте 50 микрограмм на миллилитр и выдержите их еще 15 минут. После этого переложите ткань в центрифужную пробирку объемом 10 миллилитров и промойте фрагменты свежей нейробазальной питательной средой.

Получить клеточную суспензию можно путем пропускания фрагментов ткани через пятимиллилитровую пластиковую пипетку. Далее центрифугируйте клеточную суспензию при 160 G в течение пяти минут. После этого удалите супинат с помощью пластиковой стерильной пастбищной пипетки и осторожно суспендируйте гранулу в одном миллилитре нейробазальной питательной среды с помощью автоматической пипетки объемом один миллилитр.

Далее измерьте плотность клеток с помощью счетной камеры Нейбауэра. Добавьте 10 микролитров клеточной суспензии и посчитайте количество клеток под микроскопом. Затем выполняют соответствующие расчеты, чтобы получить от 40 до 80 микролитров клеточной суспензии, которая содержит около 30 000 клеток.

В четырехлуночном планшете, содержащем 500 микролитров нейробазальной среды, играется около 30 000 клеток в каждую лунку, содержащую стеклянные покровные стекла. Держите их в инкубаторе от двух до пяти дней in vitro для молодых нейронов или более 15 дней in vitro для старых нейронов. При этой процедуре инкубируйте клетки при температуре менее 2:00 AM в течение 60 минут при комнатной температуре в темноте.

Затем переложите крышки в камеру продукции. После этого поместите камеру с крышкой в держатель на перевернутый микроскоп. Выберите микроскопическое поле и непрерывно перфузируйте клетки с помощью предварительно прогретого HBS.

Впоследствии эпи освещают клетки на 340 и 380 нанометрах. Затем поочередно записывайте свет, излучаемый с точностью 520 нанометров каждые 5-10 секунд, с помощью флуоресцентной камеры, которая фильтруется двухдиевым зеркалом. Чтобы проанализировать записанные флуоресцентные изображения, сначала откройте файл эксперимента с помощью программного обеспечения Aqua Cosmos, нажмите на ratio и выберите желаемый диапазон соотношений.

Рассчитайте попиксельное соотношение в полученных изображениях, чтобы получить последовательность изображений с соотношением. Затем вычтите фон, настроив кнопку устранения фона. После этого нажмите кнопку «Начать расчет».

Затем нажмите кнопку «Вся временная последовательность» и сотрите древние ROI для количественного анализа отдельных клеток. Установите новые ROI или ROI, соответствующие отдельным нейронам. Чтобы построить график отдельных записей, экспортируйте значения коэффициента флуоресценции, соответствующие каждому ROI, в программу Origin lab, щелкнув график.

Затем нажмите «Рассчитать» и сохраните файл TXT. После этого произведите соответствующий расчет для оценки величины повышения коэффициента флуоресценции в ответ на каждую стимуляцию трансфекции культивируемых нейронов мутантной плазмидой MIT. Сначала приготовьте во флаконе 50 микролитров раствора А, содержащего реагент для трансфекции.

Далее приготовьте 50 микролитров раствора В, содержащего во флаконе плазмиду MIT ute. Добавьте раствор Б к раствору А и выдержите 20 минут. После этого переложите покровные листы, содержащие нейроны гиппокампа, в новые мультитарелки, содержащие 200 микролитров свежей нейробазальной ТФ. Затем добавьте по 100 микролитров раствора А и В по каплям на каждую крышку и выдержите 30 минут.

Через 30 минут удалите среду. Промойте клетки свежим нейробазальным тф. После возвращения крышка соскальзывает в исходную среду для нейробазальной культуры и культивирует клетки в течение 24 часов после трансфекции, чтобы обеспечить эффективную экспрессию и нацеливание зонда.

Далее добавьте четыре микролитра герметика TEREZIN N к 200 микролитрам HBS, чтобы получить конечную концентрацию в четыре микромоляра. Аккуратно перемешайте и выдерживайте в течение двух часов при комнатной температуре в темноте. Через два часа переложите крышки в перфузионную камеру и непрерывно проварите предварительно подогретым раствором HBS.

Чтобы получить биолюминесцентные изображения концентрации кальция в митохондриях, выберите микроскопическое поле, содержащее клетки, экспрессирующие APO корин, как показано с помощью флуоресцентной эмиссии. Далее выключите свет микроскопа. Снимите коробку, содержащую дихроику, расположенную в световом пути.

Затем выключите лампочку возбуждения и закройте темный ящик для полной темноты. Перфузируйте элементы средой HBS, с тестовыми растворами или без них, предварительно нагретыми до 37 градусов Цельсия. Затем каждые 10 секунд захватывайте изображения фотонного излучения с помощью камеры подсчета фотонов, управляемой процессором обработки изображений.

Затем добавьте копать тоин, чтобы выпустить все оставшиеся фотоны для анализа биолюминесцентных изображений, отражающих митохондриальный кальций. Откройте флуоресцентное изображение GFP. Выберите отдельные ROI, нарисовав вокруг трансфицированных клеток.

Затем скопируйте и вставьте те же ROI на каждое изображение последовательности. Снимки экрана. После этого экспортируйте значения фотонного излучения для каждого ROI в конкретное программное обеспечение для расчета клик-графика.

Чтобы вычислить значения для каждого ROI, выберите общее значение и используйте текущий ROI для всех изображений. Затем нажмите «Рассчитать», сохраните текстовый файл и экспортируйте данные. Затем произведите соответствующие расчеты для оценки величины повышения уровня митохондриального кальция в ответ на каждый показанный стимул.

Вот репрезентативные светлопольные и псевдоцветные изображения краткосрочных и долгосрочных культур нейронов гиппокампа до и после стимуляции 100 микромолярами и более теплыми цветами MDA, отражающие повышенную концентрацию цитозольного кальция. Эти следы демонстрируют репрезентативные одноклеточные записи концентрации цитозольного кальция в ответ на 100 микромоляров и MDA в краткосрочных и долгосрочных культурах нейронов гиппокампа. Обратите внимание, что увеличение концентрации цитозольного кальция в долгосрочной перспективе намного больше, чем в краткосрочных культивируемых нейронах.

В этом эксперименте культивируемые нейроны гиппокампа трансфицировали низкоаффинным митохондриальным корином, слитым с GFP, инкубированным с четырехмикромолярным герметиком терезином, и подвергали биолюминесцентной визуализации концентрации кальция в митохондриях. Здесь представлены записи, которые показывают высвобождение фотоизлучений, отражающих митохондриальный кальций в краткосрочных и долгосрочных культивируемых нейронах гиппокампа. MDA 100 микромоляр увеличивал концентрацию кальция в митохондриях в старых нейронах, но не в молодых культивируемых нейронах гиппокампа После этой процедуры.

Другие методы, такие как оценка справедливой левой стороны, могут быть объединены с флуоресцентной и биолюминесцентной визуализацией в тех же клетках, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как восприимчивость к нейронным клеткам, свинец, связанный со старением, нейродегенерацией и ишемией.