Лазерным наведением нейронов в головном мозге Трассировка Экспланты

Общая цель этого метода состоит в том, чтобы пометить нейроны и их аксональные проекции, чтобы проследить их связи с целевыми или исходными ядрами мозга, представляющими интерес. Этот метод помогает ответить на ключевые вопросы нейробиологии, такие как паттерны связей между различными областями или субпопуляциями нейронов мозга, а также их функциональное значение для данной нейронной цепи. Основным преимуществом данной методики является повышенная точность стрельбы по цели во время инъекций трассеров.

Это достигается за счет использования базового оптического оборудования для визуализации флуоресцентно меченых ядер мозга. Еще одним преимуществом этого метода является то, что он позволяет проводить неинвазивное генотипирование мышиных попсов, экспрессирующих флуоресцентные белки под контролем нейронных промоторов. При генотипировании детенышей проверяют экспрессию соответствующих флуоресцентных маркеров с помощью лазерной указки с соответствующей длиной волны возбуждения.

В то же время надевайте фильтрующие очки, которые блокируют длину волны возбуждения, но пропускают длину волны излучения. Направьте лазер на затылок или спинной мозг рассматриваемого щенка. Будьте осторожны, чтобы не посветить лазером в глаза P'S и не допускайте короткой лазерной экспозиции.

Возбужденные флуоресцентные маркеры должны быть видны через кожу. Когда мышь становится старше, можно идентифицировать отдельные нейроны собранных тканей. После обезболивания мыши и проверки на отсутствие рефлекса снимите кожу над черепом, разрежьте кожу вдоль затылка до средней части черепа.

Даже у более старых мышей старше одного месяца флуоресценцию можно наблюдать через глаза животного. Затем, с помощью ледяного PBS trans Cardi, перфузируйте маркер-положительное животное с помощью иглы 30 калибра, через пять-10 минут большая часть крови будет удалена. Затем удалите мозг и препарируйте интересующую область.

Здесь трапециевидное тело, которое представляет собой два выступающих бульба в вентральной области мозга, содержит интересующую область. Вентральные ядра трапециевидных тел или VNTB начинаются с переноса исследуемой области эксплантированного мозга в чашку с насыщенным кислородом рассекающим раствором. Там. Закрепите эксплан иглами шприца 30 калибра так, чтобы область для инъекции была доступна сверху.

Для инъекции используются инъекционные пипетки из силикатного стекла Bo, которые изготавливаются в три или четыре цикла вытягивания. Загрузите в пипетку следующий раствор. Субъединица холерного токсина B конъюгирована с Alexa FLUORA 4 5 55, который в основном предназначен для ретроградного транспорта.

С помощью лазерной указки и инъекционных пипеток, установленных и готовых к использованию, луч направляется на помеченную область мозга или клетки, которые будут введены в действие. Наблюдайте за полем через полосу пропускания фильтровальных очков, чтобы увидеть, на какие нейроны следует воздействовать с помощью инъекционной пипетки. С помощью микроманипулятора поместите пипетку в интересующую область.

Затем, используя инжектор под давлением, настроенный на подачу 50-миллисекундных импульсов с частотой 15 PS, я ввожу индикаторное вещество за два-10 импульсов. Подождите от 10 до 15 секунд между импульсами, чтобы введенный краситель мог распространиться. При введении тетраэтилрумина электростимулируют область с помощью стимулирующего электрода, подающего импульсы TTL.

Убедитесь, что электрод заземлен в растворе для ванны. Подайте восемь импульсов TTL с напряжением восемь вольт каждый продолжительностью 50 миллисекунд с интервалом 50 миллисекунд. Стимулируйте область с помощью от 10 до 20 повторений пульса в течение нескольких минут.

Ядра мозга различаются по размеру, плотности нейронов и типам клеток. Это означает, что продолжительность и количество импульсов давления и/или электрических импульсов могут потребоваться для достижения оптимальных результатов маркировки для данной области мозга. С помощью лазера и защитных очков проверьте сигнал флуоресцентного индикатора.

Краситель должен быть впитан клетками и распределен по области инъекции. После инъекции инкубируйте стволы мозга в насыщенной кислородом искусственной спинномозговой жидкости при комнатной температуре в течение одного-четырех часов. Поддерживайте насыщение кислородом во время инкубации, затем закрепите ткань в 4%-ном параформном альдегиде.

В PBS в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия на следующий день ткань может быть разрезана и введена межсезонная инъекция в вентральное ядро трапециевидного тела или VNTB. Использование тетраэтилдекстрина Родина показывает, что проекции от VNTB распространяются на медиальное ядро трапециевидного тела, или MNTB. Затем в MNTB вводили chole toin, субъединицу B, которую ретро сильно обозначали VNTB.

Более подробно, соматы клеток гликоэнтерального VNTB, по-видимому, были помечены следующими. В MNTB была введена ретроградная метка dextrin tri. В отличие от точечной схемы мечения CTB, мечение трит-декстрином было плотным и похожим на GOGI.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как маркировать нейроны и их процессы с повышенной точностью. Продемонстрированная техника помогает идентифицировать области мозга и субпопуляции нейронов, участвующие в данной нейроцепи. Эту процедуру можно легко комбинировать с другими методами, такими как иммунохимия или очистка мозга, чтобы ответить на дополнительные вопросы, касающиеся морфологии, направленности или функциональности нейронных проекций и других нейронных структур.