3 января 2016 г.
Насыщаемое и обратное насыщаемое рассеяние были обнаружены в изолированных плазмонных частицах и приняты в качестве нового метода неотбеливающего контраста в микроскопии сверхвысокого разрешения. Здесь подробно объясняются экспериментальные процедуры обнаружения и выделения нелинейного рассеяния, а также способы повышения разрешения с помощью микроскопии насыщенного возбуждения.
Общая цель этого эксперимента — продемонстрировать повышение разрешения при нелинейном рассеянии от плазмонных наноструктур. В области оптической микроскопии контраст и разрешающая способность являются наиболее важными факторами. Наша методика расширяется до поля сверхвысокого разрешения с новым рассеянием на основе контраста.
Основное преимущество этого метода заключается в том, что рассеяние от наночастиц является сильным, крайне нелинейным и не обесцвечивающимся. Демонстрировать процедуру будет Сюань Ли. Лучший студент из моей лаборатории.
Эксперимент будет проводиться на оптической скамье. Где есть микроскоп и два лазерных источника. Первым источником лазера является 532-нанометровый лазер непрерывной волны, используемый для визуализации.
Второй — это сверхконтинуумный лазер, используемый для спектроскопических измерений. Это схема базовой конфигурации для визуализации и спектроскопии. Образцы будут установлены на пьезоэлектрическом позиционирующем столике в конфокальном микроскопе.
Свет от лазера с яркостью 532 нанометра проходит через фильтр нейтральной плотности. Луч направляется светоделителем на гальванозеркала, обеспечивающие сканирование растра в фокальной плоскости объектива конфокального микроскопа. Обратный рассеянный свет собирается объективом и фокусируется на детекторе.
Начните с выравнивания траектории освещения белым светом микроскопа. Используйте галогенный источник света при освещении бигуди. Чтобы проверить выравнивание внутренней радужной оболочки, обязательно наблюдайте за острыми краями восьмиугольника с помощью окуляра или ПЗС-матрицы.
Далее с помощью листа бумаги проверьте внешний световой путь. Убедитесь, что лучи частично отражаются светоделителем и распространяются по направлению к лазеру, перемещая бумагу по световому пути. Теперь у вас есть готовые бумажные цели, которые помогут в дальнейшем согласовании.
Мишени должны быть на тонкой бумаге с концентрическими кольцами. Расположите эти мишени вдоль траектории луча так, чтобы они были выровнены с галогенным лучом. В этом случае мишень находится на задней апертуре объектива.
Это еще одна цель в позиции по оптическому тракту. Затем включите лазер с яркостью 532 нанометра, используемый для визуализации, чтобы выровнять его. Используйте бумажные мишени, чтобы помочь в коллимации падающего лазерного света, противоположного галогеновому лучу.
Продолжайте более точную юстировку лазерного луча, прежде чем удалять мишени и продолжать. После юстировки лазера получить подготовленный для эксперимента образец наносферы золота. Этот образец содержит 80-нанометровые наносферы золота в нефти.
Смесь запаивается между двумя стеклянными пластинами. Продолжайте устанавливать образец на предметный столик и добавляйте объективное масло. На этом этапе система обнаружения готова к визуализации.
Соберите рассеянный свет с помощью фотоумножителя в конце оптического тракта. Позади пути луча сделайте отверстие диаметром 20 микрометров, чтобы блокировать рассеянный свет от фотоумножителя. Продолжите съемку, включив зеркала гальвано и фотоумножитель.
Наблюдайте за монитором компьютера, чтобы увидеть задний сканер в сигнале наночастиц золота. Максимизируйте сигнал заднего сканера, регулируя положение отверстия и высоту предметного столика для образца. После юстировки конфокального микроскопа определите характеристику нелинейности рассеяния образца.
Для этого сначала с помощью измерителя мощности измерьте мощность лазера после линзы объектива. Показания должны быть менее 10 микроватт, что соответствует интенсивности возбуждения менее 10 до четверти ватт на квадратный сантиметр. Затем получите изображение наночастиц золота с помощью фотоумножителя.
Откройте полученное изображение в программном обеспечении для анализа изображений, чтобы охарактеризовать профиль интенсивности рассеяния. Выберите золотую наносферу среди тех, что на изображении, и проведите через нее линию. Затем выполните действия, необходимые в программном обеспечении, чтобы получить профиль рассеивания.
Подгонка профиля по Гауссу, что позволяет дополнительно проверить юстировку системы визуализации. Теперь начните систематически сканировать интенсивность возбуждения. Сначала измените фильтр нейтральной плотности, чтобы увеличить интенсивность возбуждения.
Определите новую интенсивность возбуждения и запишите изображение обратного рассеяния на новом уровне интенсивности. Используйте изображение для извлечения профиля рассеяния наносферы, как и раньше. Постройте график профиля рассеяния и определите его значение в центре сферы как сигнал рассеяния.
Повторите эти шаги несколько раз, чтобы построить график зависимости сигнала рассеяния от интенсивности возбуждения. На этом рисунке синие точки представляют данные. Красная линия — это полиномиальная аппроксимация.
Существует линейная зависимость между сигналом рассеяния и низкими значениями энергии возбуждения. Падение ниже этой линейной зависимости указывает на то, что произошло насыщение. Следующим шагом будет проведение спектроскопии на одной наносфере золота.
На этой схеме представлен обзор конфигурации. Используйте суперконтинуумный лазерный источник с диапазоном длин волн 450-1750 нанометров. Кроме того, используйте широкополосный светоделитель 50/50 для обеспечения спектрального покрытия в видимом спектре.
Поместите переворачивающееся зеркало перед фотоумножителем, чтобы направить свет на спектрометр. Который оснащен устройством с зарядовой связью. Сверхконтинуумный лазер должен быть юстирован по той же процедуре, что и лазер с 532 нанометровым излучением.
На выходе сверхконтинуума лазера примите некоторые меры предосторожности для удаления избыточной инфракрасной мощности из системы. Поместите зеркала, отражающие видимый свет, на оптическом пути сразу после выхода лазера, прежде чем отправить луч в микроскоп. В сочетании с зеркалами используйте сбросы лучей для сбора инфракрасного излучения, которое может повредить систему.
С помощью лазера можно получить и получить изображение золотых наносфер. Просмотрите изображение и определите одну наносферу для изучения. Зафиксируйте фокус падающего широкополосного света на выбранную наносферу.
Далее убедитесь, что спектрометр находится на оптическом тракте. В этом положении переворачивающееся зеркало направляет падающий свет на фотоумножитель. Измените ориентацию зеркала, чтобы направить падающий свет на спектрометр.
Приступайте к сбору данных о спектре рассеяния одиночной наночастицы золота. Как и в этом примере, измеряемый спектр будет представлять собой смесь рассеяния наносферы и фона из-за отражений. После снятия спектра верните откидное зеркало.
Поверните его так, чтобы прямой свет попал на фотоумножитель. Сделайте еще один снимок, чтобы убедиться, что наночастица золота не изменила своего положения. Затем сместите фокус широкополосного света в точку, где нет частиц.
Снова измените зеркало, чтобы направить свет на спектрометр, и перейдите к повторному измерению спектра. Новый спектр находится на заднем плане. Он будет вычтен из спектра наносферы золота.
Вот четкий спектр обратного рассеяния, полученный путем вычитания фонового спектра из спектра с золотыми наносферами. Микроскопия образца с насыщенным возбуждением требует другой настройки. Такова схема микроскопа насыщенного возбуждения.
Источником лазера является лазер с яркостью 532 нанометра. Используйте светоделитель 50/50 для создания двух лучей от лазерного источника. Пропустите каждый луч через отдельный акустальный оптический модулятор.
Различные частоты модулятора генерируют частоту биения, которая будет служить частотой модуляции насыщенных сигналов возбуждения. Объедините дифрагированные лучи первого порядка от акустальных оптических модуляторов с другим светоделителем 50/50. Чтобы контролировать временную модуляцию, используйте предметное стекло, чтобы разделить небольшую часть лазерного света на фотодетектор.
Чтобы проверить систему, подключите фотодетектор к осциллографу. Убедитесь, что образец отсутствует. Оцените сигнал фотодетектора на осциллографе.
Сигнал должен быть синусоидой на частоте биения, если модуляция и перекрытие луча правильные. Для этого эксперимента ожидаемая частота биения составляет 10 килогерц. Приложите усилия, чтобы добиться как можно более идеальной синусоиды с минимальной нелинейностью.
Следующим шагом является встраивание в систему синхронного усилителя. Для микроскопии с насыщенным возбуждением синхронный усилитель имеет вход от фотодетектора и фотоумножителя. Отсоедините выход фотоприемника от осциллографа и подключите его к опорному входу усилителя.
Подключите выход фотоумножителя к синхронному усилителю в качестве входного сигнала. Отправка выходного сигнала с усилителя на плату сбора данных. На этом этапе установите образец на предметный столик микроскопа.
Используйте тот же образец с 80-нанометровыми наносферами золота в масле, запечатанными между двумя стеклянными пластинами. Вернитесь к синхронному усилителю во время выполнения измерений. Настройте усилитель на экспорт абсолютной величины сигнала напряжения.
В данном случае, выбрав R"на панели отображения канала 1. Измените настройку гармонической составляющей на опорном канале для получения насыщенных одиночных амплитуд возбуждения. Эти цветные изображения формируются с помощью специального программного обеспечения для синхронизации и объединения сигналов от синхронного усилителя и управляющих напряжений гальваномоторов.
Изображение с помощью сканирующего электронного микроскопа предназначено для сравнения. Изображения демонстрируют повышение разрешения с помощью различных гармонических составляющих. Измеренный спектр 80-нанометровой наносферы золота выделен красным цветом.
Твердотельная кривая, рассчитанная с использованием теории Ми, показывает отличное согласие. Локализованный поверхностный плазмонный резонанс находится на уровне 580 нанометров. Изображения рассеяния вверху и профили линий внизу имеют различные особенности в зависимости от интенсивности возбуждения.
При низкой интенсивности функция разброса точки представляет собой стандартный гауссов профиль. Более высокие интенсивности приводят к сглаживанию и расширению функции, что указывает на насыщенность. При более высоких значениях центральная интенсивность не является максимальной, что приводит к функции разброса точки в форме бублика.
В конце концов, центральная интенсивность снова становится пиковой во время обратного насыщения. Синие точки данных на этом графике центральной интенсивности при различных интенсивностях возбуждения показывают поведение как при насыщении, так и при обратном насыщении. Точки данных подогнаны к полиному 5-го порядка, нанесенному красным цветом.
Эти данные могут быть использованы для извлечения гармонических частотных составляющих. Гармонические составляющие также могут быть найдены непосредственно с помощью синхронного усилителя. Этот левый график основан на экспериментальных данных.
Правый график является результатом вычисления с использованием подгонки полинома 5-го порядка. Оба графика демонстрируют провалы при определенной интенсивности вдоль кривых. Например, три провала во второй гармонике.
Также на каждом участке для каждого гармонического порядка наклон увеличивается после первого падения. После освоения этой техники ее можно выполнить менее чем за три часа, если вы выполните ее правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно проверить качество синусоидальной модуляции, линейность системы детектирования и механическую стабильность образца.
После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как добиться повышения разрешения на основе нелинейного рассеяния от плазмонных наноструктур. Этот метод предоставляет исследователям в области микроскопии сверхвысокого разрешения перспективный образец для изучения нового контраста в других фундаментальных взаимодействиях света и материи.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
В данной работе исследуется повышение разрешения в оптической микроскопии за счет нелинейного рассеяния на плазмонных наноструктурах. Этот метод использует сильное, высоконелинейное и устойчивое к выгоранию рассеяние на наночастицах для улучшения контраста и разрешения.
Нелинейное рассеяние на плазмонных наноструктурах позволяет повысить разрешение в оптической микроскопии без фотообесцвечивания, что устраняет ключевое ограничение при визуализации живых клеток и лонгитюдных исследованиях. Данный подход обеспечивает механизм контрастирования без выгорания, что повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет возможности многократных измерений биологических структур во времени. Зависимость метода от локализованного поверхностного плазмонного резонанса (LSPR) открывает возможности для снижения механистических рисков при разработке анализов посредством модуляции сигнала в зависимости от интенсивности.
Данный метод вписывается в континуум разработки — от ранней валидации мишени до доклинической оценки, при этом нелинейное рассеяние служит стабильным и количественным показателем для изучения механизмов действия и оптимизации зондов.