Электротаксис Исследования клетки легких рака с использованием многоканального Dual-электрического поля микрофлюидных Chip

Общая цель данного микрофлюидного эксперимента заключается в оценке влияния ингибиторов киназ на миграцию опухолевых клеток под воздействием прямого электрического поля. Таким образом, данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в исследованиях электротаксиса клеток, например, какие пути являются определяющими при миграции раковых клеток, направляемой электрическим полем. Основным преимуществом этой методики является то, что она представляет собой высоковоспроизводимый и экономящий время способ изучения электротаксиса, который может быть легко внедрен.

Значение данного метода распространяется на диагностику метастатического потенциала рака. Поскольку подвижность магнитных раковых клеток может быть усилена электрическим полем, данный способ позволяет проводить внутриклеточное электротестирование опухолевых клеток.

Данный метод также может быть применен в процессах регенерации кожи, например, при заживлении ран. Сначала с помощью программы для черчения и проектирования создайте шаблон отдельного акрилового слоя. Сохраните шаблон, после чего включите лазерный гравер.

Подключите гравер к управляющему ноутбуку и нажмите на файл с заданным рисунком, чтобы открыть шаблон слоя акрила. Затем поместите заготовку из акрилового листа на платформу с осями x, Y, Z лазерного гравера и используйте соответствующую палочку для автоматического выравнивания лазерного гравера, чтобы настроить фокус лазерного луча на поверхности листа.

Отправьте разработанный шаблон на лазерный гравер для непосредственной обработки акрилового листа. Затем с помощью пинцета снимите защитную бумагу с акриловых листов и очистите поверхности потоком азота. Теперь сложите листы друг на друга и соедините их в термопрессе при давлении 2 кг/см² в течение 45 минут при температуре 110 °C для формирования сборки каналов потоковой электрической стимуляции.

Подготовив двусторонний скотч таким же образом, прикрепите чистую покровную стеклянную пластинку к узлу канала электрической стимуляции потока. Затем с помощью суперклея прикрепите 13 акриловых адаптеров к отдельным отверстиям в первом слое многоканального узла двойного электрического поля или узла чипа MDF для создания сети солевых мостиков чипа MDF. Начните с подключения пластиковых трубок к узлу чипа MDF через адаптеры входа и выхода среды.

Затем подсоедините конусные наконечники средних пластиковых трубок входа и выхода к трехходовым кранам. Подключите трехмиллилитровый шприц, содержащий 2,5 мл PBS, насыщенного углекислым газом, к трехходовому крану входной пластиковой трубки, а пустой трехмиллилитровый шприц — к трехходовому крану выходной пластиковой трубки. Используйте белые сплошные зажимные гайки для герметизации отверстий синего и зеленого адаптеров на акриловом листе первого слоя. Затем заполните каналы солевого мостика и камеры для культур PBS, насыщенным углекислым газом, стараясь избегать образования пузырьков.

Перенесите чип в инкубатор для культур клеток с температурой 37 °C и содержанием 5% carbon dioxide на ночь, чтобы растворенный в двустороннем скотче воздух к следующему утру образовал пузырьки внутри камер. С помощью двух шприцев создайте быстрый поток PBS для вымывания пузырьков, при необходимости прокачивая PBS вперед и назад. После удаления всех пузырьков используйте трехходовой кран, подключенный к трубке выхода среды, чтобы слить PBS из каналов.

Затем замените шприц, подключенный к входному отверстию, на шприц объемом 3 мл, содержащий 2.5 мл среды DMEM, уравновешенной по CO₂, и заполните камеры средой до полного заполнения. Снимите фиксирующие гайки с зеленых адаптеров и введите 3% agarose, нагретый минимум до 70 °C, в канал солевого мостика. Через отверстия в адаптерах горячий agarose формирует солевой мостик для инъекции, обеспечивая блокировку среднего ряда между культуральными камерами.

Прекратите впрыскивание агароза, когда соединение заполнит три четверти длины канала солевого мостика, и загерметизируйте поры с помощью сплошных гаек. Теперь замените сплошные гайки на синих адаптерах на полупрозрачные трубчатые гайки, затягиваемые пальцами, и залейте агароз в трубчатые гайки. Затем, до затвердевания агарозы, установите в трубчатые гайки электроды из серебра и хлорида серебра.

Для подготовки эксперимента по электротаксису введите 0,3 мл клеток в чип MDF через выходную трубку, после чего верните чип в инкубатор для культур клеток. Через два-четыре часа установите микрофлюидную систему MDF на прозрачный нагреватель из стекла, покрытого оксидом индия-олова, и закрепите термопару K-типа между чипом MDF и стеклом с оксидом индия-олова. Чтобы измерить температуру чипа, используйте пропорционально-интегрально-дифференцирующий регулятор для установки температуры инкубации микрофлюидной системы MDF на 37 °C, а затем зафиксируйте узел чипа MDF с контролем температуры на управляемом компьютером моторизованном XYZ-столике инвертированного микроскопа.

Затем с помощью четырехканального шприцевого насоса подайте полную среду в культуральные камеры через входные отверстия со скоростью потока 20 µL в час. Собирайте отработанную культуральную среду из выходных отверстий в микроцентрифужные пробирки. Инкубируйте клетки при 37 °C еще в течение 16–18 часов.

На следующий день замените среду в каждой камере на свежую среду с соответствующей концентрацией ингибитора киназы для 60-минутной обработки. Затем последовательно подключите источник питания постоянного тока к чипу MDF через электроды из серебра и хлорида серебра. Подключите амперметр к электрической цепи для мониторинга силы электрического тока в чипе MDF.

Наконец, включите источник питания и установите напряжение в диапазоне от 15 до 19 вольт. Установите ток амперметра на 86,94 microamps. В данном репрезентативном эксперименте с использованием микрофлюидной системы MDF клетки рака легкого подвергались воздействию различных концентраций ингибитора киназы.

Y 2 7 6 3 2 не вызывал изменений скорости миграции клеток независимо от наличия электрической стимуляции. Однако обработка Y 2 7 6 3 2 в присутствии электрического поля значительно снизила извилистость траектории миграции раковых клеток. В частности, при концентрации 50 micromolar ингибитор rock полностью устранил извилистость движения клеток, не повлияв при этом на скорость их миграции.

Более того, была выявлена дозозависимая корреляция между применяемыми концентрациями химических веществ и индексом направленности, что подтверждает надежность и эффективность микрофлюидной системы MDF как метода изучения аксонов. После освоения данная методика может быть выполнена за семь-восемь часов при условии правильного проведения после этапа разработки. Эта техника открывает перед исследователями в области электрофизиологии новые возможности для изучения процессов в коже.

Не забывайте, что работа с лазерным скрапером может быть крайне опасной, и при выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать меры предосторожности.