Прививка шариков в развивающихся куриных эмбрионов Конечности выявлять пути передачи сигналов, влияющие экспрессии генов

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы показать, как можно определить влияние факторов роста и ингибиторов на экспрессию генов развивающихся конечностей куриного эмбриона. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы биологии развития, например, как сигнальные молекулы влияют на рост и дифференцировку клеток in vivo. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она предоставляет метод проверки этих факторов непосредственно на эмбрионе.

Хотя этот метод может дать представление о развитии конечностей, он также может быть применен к другим системам, таким как нервная ткань, сомиты или гаструляция. Демонстрировать процедуру будет Ребия Мохаммед, аспирант из моей лаборатории. Для начала переложите один миллилитр шариков из исходного исходного раствора бусин в свежую пробирку.

Дайте шарикам осесть, затем удалите жидкость и замените ее одним миллилитром PBS. Повторите этот шаг пять раз и храните промытые бусины при температуре четыре градуса Цельсия, как кашицу в PBS. Выберите бусины для прививки, вынув их из промытого подвойного раствора с помощью пипетки объемом 20 микролитров и поместите в один миллилитр PBS.

Используя стереоскоп, выбирайте бусины диаметром около 100 микрон. Переложите выбранные бусины в двух микролитрах жидкости в новую чашку Петри, содержащую каплю PBS объемом 20 миллилитров. Сначала с помощью пипетки объемом 20 микролитров, а затем удалите остатки жидкости капиллярным действием с помощью тонких часовых щипцов.

Важно удалить как можно больше жидкости, чтобы фактор роста не разбавлялся при добавлении в бусины. Пипеткой нанесите фактор роста непосредственно на бусины. Для FGF18 добавьте 0,5 микролитра рекомбинантного FGF18, восстановленный добавьте 0,5 мг на миллилитр в PBS с 0,1 процентом BSA.

Затем налейте несколько капель воды по краям посуды, чтобы жидкость не испарилась. Когда все будет готово, выдержите бусины в течение одного часа при комнатной температуре. После инкубации удалите капли воды из чашки с помощью пастеровской пипетки и поставьте чашку на лед.

Дериватизируйте шарики, сначала с помощью шпателя перенесите шарики в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Затем добавьте один миллилитр 0,2 нормальной муравьиной кислоты и выдержите шарики в кислоте на встряхивающей платформе в течение одного часа. Далее дайте шарикам осесть, удалите муравьиную кислоту и замените ее одним миллилитром воды.

Постирайте бусины в течение одного часа на встряхивающей платформе и повторите стирку шесть раз, чтобы удалить остатки муравьиной кислоты. После последней стирки удалите остатки жидкости и храните бусины при температуре четыре градуса Цельсия. С помощью шпателя извлеките из запаса небольшую палитру бусин объемом примерно пять-десять микролитров и поместите бусины в чашку Петри объемом 30 миллилитров.

Затем добавьте один миллилитр ДМСО. Далее с помощью пипетки Р2, установленной на два микролитра, перенести шарики диаметром примерно 100 микрон, каплю растворителя 20 микролитров в другую чашку Петри объемом 30 миллилитров. Удалите основную часть растворителя с помощью пипетки объемом 20 микролитров, а остатки растворителя — с помощью пипетки объемом два микролитра.

Затем накройте бусины 20 микролитрами наносимого препарата, растворенного в ДМСО. Выдержите шарики в растворе препарата в течение одного часа. Бейте шарики от света, так как многие молекулы лекарств чувствительны к свету.

Чтобы помочь визуализировать бусины, перелейте четыре-пять бусин в два микролитра жидкости, в 20 микролитров двухпроцентного фенолового красного, растворенного в воде. Удалите одну бусину тонкими щипцами часовщика и промойте бусину в PBS. Не оставляйте шарики в фенольном красном растворе более чем на 15 минут перед их полосканием, так как это может привести к потере активности.

Разрежьте тонкую вольфрамовую проволоку на длину три-четыре сантиметра Затем вставьте один кусок проволоки в конец стеклянной пипетки Пастера и расплавьте в горелке Бунзена, чтобы зафиксировать ее на месте. Подготовьте до 10 игл, чтобы убедиться в наличии запасных на случай их повреждения. Затем поместите конец проволоки в пламя паяльной лампы и удерживайте его там, пока вольфрам не станет белым, а кончик не станет острым.

Это занимает около двух-трех минут. Добавьте пять-шесть капель художественных индийских чернил в 15 миллилитров PBS, содержащих 100 единиц пенициллина и 0,1 миллиграмма стрептомицина на миллилитр. Чтобы подготовить куриные эмбрионы, инкубируйте яйца тупым концом до тех пор, пока они не достигнут желаемой стадии для большинства манипуляций с зачатками конечностей, которая обычно составляет от трех до пяти дней.

Когда желаемый временной момент будет достигнут, с помощью тупых щипцов постучите по тупому концу яйца и разбейте скорлупу. Затем с помощью щипцов удалите оболочку и обнажите эмбрион. Убедитесь, что мембрана яйцеклеток также удалена.

Чтобы визуализировать эмбрион, введите PBS с добавлением нескольких капель художественных индийских чернил, под эмбрион с помощью одномиллилитрового шприца и иглы 21 калибра. Вителлиновая мембрана, находящаяся над эмбрионом, затем может быть удалена с помощью тонких щипцов. Затем добавьте в яйцеклетку два-три миллилитра дополненного PBS с одним процентом эмбриональной телячьей сыворотки, 100 единиц на миллилитр пенициллина и 0,1 мг на миллилитр стрептомицина, чтобы гарантировать, что эмбрион не обезвоживается.

С помощью заточенных часовых щипцов раскройте амнион над развивающимися зачатками конечностей. На этих стадиях эмбрион обычно поворачивается так, что правая сторона находится верхнее. Следите за тем, чтобы эмбрион не высыхал, добавляя больше дополненного раствора PBS, когда это необходимо.

Амнион, окружающий эмбрион, может быть открыт с помощью тонкой вольфрамовой иглы, чтобы показать развивающуюся конечность. Затем с помощью заточенной вольфрамовой проволоки сделайте надрез в зачатке конечности, куда будет имплантирована бусина. По возможности избегайте разрезания по всей длине бутона конечности.

Хотя на более ранних этапах это сложно. Возьмите бусину, покрытую либо фактором роста, либо лекарством с помощью очень тонких щипцов часовщика. Если шарик был пропитан ДМСО или феноловым красным, убедитесь, что он был промыт PBS перед нанесением на эмбрион.

Перенесите бусину к эмбриону с помощью щипцов, а затем с помощью заточенной вольфрамовой проволоки вставьте бусину в место разреза. Добавьте еще один-два миллилитра дополненного раствора PBS в яйцеклетку, чтобы обеспечить увлажнение эмбриона. Избегайте нанесения раствора непосредственно на сам эмбрион, так как это может повредить эмбрион и привести к смещению шарика.

Затем используйте десятимиллилитровый шприц, оснащенный иглой 19 калибра, чтобы удалить только столько альбумина, сколько необходимо для того, чтобы эмбрион не соприкасался с лентой, используемой для запечатывания яйцеклетки. Следите за тем, чтобы игла не повредила желток, проведя им вниз по внутренней части скорлупы. Наконец, заклейте яйцо скотчем и верните его в инкубатор.

Чтобы подтвердить, что FGF18 способен действовать через MEK для фосфорилирования ERK, эмбрионы были собраны через час после прививки бусин и иммуноокрашены на наличие фосфорилированной ERK, которую можно увидеть вокруг привитой бусины на изображении справа. На стадии 21 ГГ MyoD не экспрессируется в развивающихся миобластах конечностей. Хотя в миотоме развивающихся сомитов можно заметить окрашивание.

Через шесть часов после трансплантата бусины FGF18 можно увидеть, как MyoD индуцируется в миобласте рядом с бусиной. При этом отсутствует мимика в контралатеральной конечности. Эта экспрессия может быть ингибирована путем ко-прививки бусины, покрытой ингибитором MEK, таким как U0126.

Аналогичным образом, пересадка бусины U0126 на стадии HH 21 снижает эндогенную экспрессию MyoD через 24 часа по сравнению с необработанной контралатеральной конечностью. В зачатках конечностей на 19-й стадии HH FGF18 не индуцирует MyoD. Тем не менее, совместное прививка бусин, пропитанных FGF18, и антагониста ретиноевой кислоты может преодолеть это, и обнаруживается эктопический MyoD.

После освоения этой техники ее можно выполнить за три-четыре минуты, если она выполнена правильно. Разработка этой методики позволила исследователям в области биологии развития изучить сигнализацию факторов роста в развитии эмбриона. При попытке использовать эту технику важно помнить, что нельзя допускать высыхания эмбриона.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как прививать бусины развивающимся эмбрионам, чтобы определить, как сигнализация факторов роста влияет на развитие.