Оптогенетика Функциональная МРТ

Общая цель данной процедуры визуализации заключается в сочетании фМРТ с оптогенетической стимуляцией для клеточно-специфического картирования функциональных нейронных цепей и их динамики во всем живом мозге. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, такие как определение роли конкретных элементов мозговых цепей в управлении глобальной активностью мозга. Основным преимуществом данной техники является то, что она позволяет осуществлять клеточно-специфическую стимуляцию и получать данные о глобальной активности мозга с относительно высоким пространственным разрешением.

Эту процедуру продемонстрируют Цзя Лю и Чжуннань Фан, аспиранты моей лаборатории. После проведения анестезии животного, как описано в текстовом протоколе, сбрейте шерсть на голове электрической бритвой и выполните тройную хирургическую обработку кожи с использованием Бетадина и ополаскиванием 70% ethanol. Затем зафиксируйте череп животного в стереотаксическом аппарате.

С помощью скальпеля сделайте срединный разрез кожи головы длиной от 15 до 20 миллиметров. Отразите кожу, используя хирургические гемостатические зажимы, зафиксированные на надкостнице. Определите положение лямбды и брегмы на черепе, затем установите сверло над исследуемой областью (ROI).

С помощью стоматологического бора выполните небольшую краниотомию над ROI, стараясь не повредить ткани мозга. Медленно введите иглу, присоединенную к микролитровому шприцу, через отверстие краниотомии в ROI головного мозга. Затем с помощью контроллера микрошприцевого насоса введите 2 µL раствора вектора в ROI.

После завершения инъекции подождите 10 минут, затем медленно извлеките шприц со скоростью 0.5 millimeters per minute. После инъекции просушите поверхность черепа. Подтвердите координаты области интереса (ROI) и введите имплантат феррулы до целевой глубины со скоростью 0.5 millimeters per minute.

Наконец, зафиксируйте имплантат с феррулой на черепе с помощью стоматологического цемента. После затвердевания стоматологического цемента ушейте разрез вокруг колпачка из цемента. Начните с подключения оптоволоконного патч-корда к источнику лазерного излучения, а затем измерьте выходную мощность на конце наконечника патч-корда с помощью измерителя мощности.

Установите соответствующий уровень мощности для получения желаемого выходного сигнала на конце оптоволоконного кабеля, имплантированного в мозг. Чтобы предотвратить утечку света из имплантата, прикройте глаза животного. Затем поместите катушку над головой животного.

Используйте обжимную втулку, чтобы зафиксировать оптоволоконный кабель в имплантируемой ферруле. Поместите люльку с животным в апертуру сканера. В течение всего эксперимента контролируйте частоту дыхания, приливной CO2 и температуру тела, регулируя работу аппарата искусственной вентиляции легких для поддержания физиологических показателей в пределах нормы.

Подключите BNC-кабели от триггерного порта МРТ-сканера к генератору функций. Выберите последовательность позиционирования и нажмите «scan» в окне управления. Нажмите «continue», чтобы визуализировать положение головы животного.

Если мозг находится не в изоцентре, скорректируйте положение головы животного и повторите сканирование для позиционирования до тех пор, пока мозг не окажется в изоцентре. Получите анатомическое изображение высокого разрешения, чтобы проверить общую целостность мозга и подтвердить местоположение имплантированного оптического волокна. Затем выберите Т2-взвешенную последовательность.

Отрегулируйте количество срезов, затем нажмите «scan» для получения Т2-взвешенных корональных анатомических изображений высокого разрешения. Наконец, выберите многосрезовую последовательность градиентного эха (GRE), затем нажмите «continue» для получения функционального изображения. В данном протоколе используется оптогенетическая фМРТ для стимуляции моторной коры на животной модели.

На этой карте активации показаны активированные воксели в моторной коре и таламусе, что указывает на наличие дальних синаптических связей между этими областями. Здесь жирным сигналом отмечены активные воксели в моторной коре и таламусе во время оптогенетической стимуляции моторной коры. Функция гемодинамического ответа таламуса демонстрирует запаздывание относительно ответа в моторной коре после стимуляции.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понять, как проводить имплантационные операции и оптогенетическую функциональную магнитно-резонансную томографию. После освоения эта процедура визуализации может быть выполнена за два часа. При выполнении данной процедуры очень важно следить за животным и поддерживать его физиологические показатели в пределах нормы.

После выполнения данной процедуры можно использовать дополнительные методы, такие как электрофизиология для исследования временной динамики нейронной активности или иммуногистохимия для подтверждения экспрессии и специфичности опсина. Разработка этого метода позволила нейробиологам исследовать функциональную связность в интактном живом мозге. Помните, что работа с МРТ-сканером может быть крайне опасной.

При выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать меры предосторожности, такие как обеспечение достаточного расстояния между магнитным оборудованием и сканером.