Оптогенетика Функциональная МРТ

Общая цель этой процедуры визуализации состоит в том, чтобы объединить F-МРТ с оптогенетической стимуляцией для специфического для типа клеток картирования функциональных нейронных цепей и их динамики во всем живом мозге. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, такие как определение роли конкретных элементов мозговой цепи в управлении глобальной мозговой активностью. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет проводить клеточно-специфическую стимуляцию и считывать глобальную активность мозга с относительно высоким пространственным разрешением.

Демонстрировать эту процедуру будут Цзя Лю и Чжуннань Фан, аспиранты моей лаборатории. После обезболивания животного, как описано в текстовом протоколе, побрейте голову электрической бритвой и выполните тройной хирургический скраб на коже с использованием бетадина и ополаскивателя из 70% этанола. Далее обездвиживают череп животного в стереотаксическом аппарате.

С помощью скальпеля сделайте разрез по средней линии кожи головы диаметром от 15 до 20 миллиметров. Втяните волосистую часть головы с помощью хирургических гемостатиков, прикрепленных к надкостнице. Определите места расположения лямбда и брегма на черепе, затем расположите сверло над интересующей областью, или ROI.

Просверлите небольшой трепанацию черепа над ROI с помощью стоматологической бормашины, стараясь не проколоть мозг. Медленно введите иглу, прикрепленную к микролитровому шприцу, через трепанацию черепа в ROI в мозге. Затем с помощью контроллера микрошприцевого насоса введите два микролитра векторного раствора в ROI.

После того, как инъекция будет завершена, подождите 10 минут, затем медленно извлеките шприц со скоростью 0,5 миллиметра в минуту. После укола подсушите поверхность черепа. Подтвердите координаты для ROI и вставьте имплантат с наконечником на заданную глубину со скоростью 0,5 миллиметра в минуту.

Наконец, установите имплантат с наконечником на череп с помощью стоматологического цемента. После того как стоматологический цемент застынет, запечатайте разрез швами вокруг колпачка стоматологического цемента. Начните с подключения оптоволоконного патч-кабеля к лазерному источнику света и измерьте выходную мощность на кончике ствола патч-кабеля с помощью измерителя мощности.

Отрегулируйте соответствующий уровень мощности, чтобы получить желаемый выходной сигнал на кончике оптоволоконного кабеля, который имплантируется внутрь мозга. Предотвратите утечку света из имплантата, закрыв глаза животного. Затем наденьте катушку на голову животного.

Используйте втулку с наконечником, чтобы удерживать оптоволоконный кабель на имплантате с наконечником. Вставьте люльку с животным в отверстие сканера. Контролируйте частоту дыхания и приливную концентрацию CO2 и температуру тела на протяжении всего эксперимента, регулируя аппарат искусственной вентиляции легких для поддержания физиологических значений в надлежащих пределах.

Подключите кабели BNC от пускового порта МРТ-сканера к генератору функций. Выберите последовательность позиционирования и нажмите кнопку «Сканировать» в окне операции. Нажмите «Продолжить», чтобы увидеть расположение головы животного.

Если мозг не находится в изоцентре, отрегулируйте положение головы животного и повторяйте сканирование позиционирования до тех пор, пока мозг не окажется в изоцентре. Получите анатомическое изображение с высоким разрешением, чтобы проверить общую целостность мозга и подтвердить местоположение оптического волоконного имплантата. Затем выберите взвешенную последовательность T2.

Отрегулируйте количество срезов, а затем нажмите кнопку «Сканировать», чтобы получить взвешенные Т2 корональные анатомические изображения с высоким разрешением. Наконец, выберите многосрезовую градиентную эхо-последовательность, затем нажмите «Продолжить», чтобы получить функциональное изображение. Этот протокол использует оптогенетическую F-MRI для стимуляции моторной коры головного мозга на животной модели.

Эта карта активации показывает активированные воксели в моторной коре и таламусе, указывая на дальнодействующие синаптические связи между этими областями. Здесь жирный сигнал показан для активных вокселей в моторной коре и таламусе во время оптогенетической стимуляции моторной коры. Функция гемодинамической реакции таламуса показывает замедленную реакцию относительно реакции в моторной коре головного мозга после стимуляции.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить операции по имплантации и оптогенетическую функциональную магнитно-резонансную томографию. После освоения эта процедура визуализации может быть завершена за два часа. Предпринимая эту процедуру, очень важно следить за животным и поддерживать его физиологию в пределах нормы.

После этой процедуры можно использовать дополнительные методы, такие как электрофизиология для исследования временной динамики нейроактивности или иммуногистохимия для подтверждения экспрессии и специфичности опсина. Разработка этого метода проложила путь нейробиологам к исследованию функциональных связей в неповрежденном, живом мозге. Не забывайте, что работа с МРТ-сканером может быть крайне опасной.

При выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как хранение магнитного оборудования на достаточном расстоянии от сканера.