Измерение Вложений и интернализации вируса гриппа в клетках А549 методом проточной цитометрии

Общая цель этой процедуры заключается в измерении прикрепления и интернализации гриппа. Вирус встраивается в 5 49 эпителиальных клеток легких. Это достигается путем первого холодового связывания вирусом гриппа с 549 клетками, что позволяет прикрепляться, но предотвращает поглощение вирусных частиц.

Затем вирусу позволяют интернализоваться путем сдвига температуры до 37 градусов по Цельсию. Затем этап блокирования, на котором немеченый стрп Аден связывается с поверхностью клетки. Прикрепление вирусов проводится для того, чтобы различать прикрепленные и внутренние вирусные частицы.

Наконец, биотинилированный вирус, ассоциированный с клеткой, инкубируют с трем меченным стрептавидином CY, и для обнаружения окрашенных вирусов используют проточную цитометрию. В конечном счете, рассчитывается относительное количество прикрепленных и интернализованных вирусов. Хотя этот метод может дать представление об относительном количестве гриппа, вирус прикрепляется и интернализуется в 5009 клеток.

Он также может быть применен к другим системам с использованием других клеточных линий или других вирусов После создания биотинилированного вируса стрептококка и определения требуемых количеств меченого вируса стрептококка и SI трех меченых стрептококковых динов в соответствии с текстовым протоколом, подготовьте четыре глубокие луночные пробирки, каждая из которых содержит 200 000, А 5 49 клеток, помеченных как ноль минут. Ноль минут, плюс STV, 30 минут и 30 минут плюс STV. Далее вращаем трубки.

Удалите надосадочную жидкость и используйте 200 микролитров PBS для ресуспендирования гранул. Затем после повторного вращения пробирок используйте 200 микролитров стандартной питательной среды 5:49 для ресуспендирования клеток Инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут после инкубации центрифугируйте образцы и повторно суспендируйте гранулы в 200 микролитрах PBS Повторив промывку еще раз, охладите пробирки на льду в течение 10 минут. Когда пробирки остынут, снова отжмите и используйте 100 микролитров биотинилированного вируса, разведенного в инфекции PBS, чтобы повторно суспендировать гранулы после инкубации на льду в течение одного часа, повторите отжим и промойте PBS дважды, обрабатывая следующие образцы параллельно, насколько это возможно, для образцов нулевой минуты.

После отжима используйте 100 микролитров 3,7%-ного параформного альдегида или PFA для ресуспендирования клеточной гранулы. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут перед отжимом и использованием PBS для промывания клеток дважды после фиксации. Хранить при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока все образцы не будут обработаны.

Для обработки образцов с нулевой минутой и STV пробирки вращаются, удаляют надосадочную жидкость и используют 15 микролитров STV 2% BSA и 0,1% ази натрия в PBS для ресуспендирования клеточных гранул и инкубируйте их на льду в течение 30 минут. Затем центрифугируйте и используйте PBS для промывки клеток дважды после фиксации PFA, как только что было продемонстрировано при четырех градусах Цельсия для 30-минутных образцов. После вращения и удаления суперната используйте PBS 2% BSA для растворения образцов.

Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут перед промывкой PBS и фиксацией PFA. Затем храните образцы при температуре четыре градуса Цельсия в течение 30 минут плюс образцы STV. После гранулирования мы суспендируем образцы в 200 микролитрах PBS 2% BSA после инкубации при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут.

Спин и ресуспендирование клеток в 50 микролитрах STV 2% BSA 0,1% Ази натрия в PBS инкубировать на ICE в течение 30 минут перед промывкой и фиксацией. Затем после проницаемости и окрашивания всех образцов STV SI 3, следуя деталям в текстовом протоколе, хранили образцы при температуре четыре градуса Цельсия. Наконец, проанализируйте образцы с помощью проточной цитометрии.

Определите процентное содержание трех положительных клеток CY в каждом образце. Рассчитайте процент прикрепленного вируса и относительное количество интернализованного вируса. В соответствии с текстовым протоколом, показанным здесь в образце нулевой минуты, вирус связан холодом с клетками-мишенями, что визуализируется St.V.SI помощью трех окрашиваний.

При применении STV в качестве блокирующего шага вирус на поверхности клетки уже не может быть обнаружен с помощью окрашивания S-St.V.SI трех, что значительно снижает сигнал. Когда температура поднимается до 37 градусов по Цельсию, прикрепленный вирус проникает в клетки. Интернализованный вирус не чувствителен к блокировке с помощью немеченого STV, что приводит к менее резкому снижению интенсивности сигнала в течение 30 минут и более показанных образцов STV.

Вот процентное соотношение трех положительных клеток СИ для всех экспериментальных условий, описанных в этом видео. Фиктивные инфицированные клетки придают интенсивность фонового сигнала для эксперимента и выступают в качестве отрицательного контроля для прикрепления вируса. Другая контрольная нейраминидаза сильно отменяет прикрепление IAV на 90% по сравнению с необработанными клетками.

Ази натрия, который истощает ТП, тем самым ингибируя эндоцитоз, ингибировал интернализацию вирусных частиц как во время, так и после заражения, как показано здесь после обработки азиязия натрия клетки, инкубированные в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия, показали резкое снижение интернализации по сравнению с необработанными клетками, инкубированными в тех же условиях. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как измерить прикрепление и интернализацию вируса гриппа в 500 9 клетках. Этот протокол обеспечивает удобное считывание данных с помощью проточной цитометрии и может быть легко адаптирован к другим экспериментальным условиям.