Мембранные процессы переноса анализироваться Высококвалифицированные параллельной системы нанопор чип Разрешение одного белка

Общая цель этой платформы на основе наноструктурных чипов заключается в анализе функции мембранного белка на одном молекулярном уровне с высокой степенью параллельности. Благодаря его способности разрешать отдельные белки можно получить новые сведения о мембранном транспорте и потоке. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области мембранных белков, такие как проводимость или транспортное поведение отдельных каналов или транспортеров, особенно в случае с неэлектрогенным грузом.

Основным преимуществом этой технологии является ее высокий параллелизм, полученный за счет создания наноструктурного чипа с сотнями тысяч нанопор и флуоресцентным считыванием транспортных событий. Применение этого метода распространяется и на то, что позволяет создавать лучшие анализы эффективных библиотек мембранных белков. Потому что платформа на основе чипа обеспечивает параллельную и автоматическую транспортную запись.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, быстро научатся обращаться с представленной техникой. Основное внимание всегда уделялось созданию удобного для пользователя анализа, чтобы все заинтересованные могли его принять. В этом анализе мембранного транспорта используется кремний на изолированной пластине, спроектированный с использованием реакционного ионного травления.

Из каждой пластины изготавливается около 1000 пробных чипов. Каждый чип содержит 250 000 микрополостей. Эти полости запечатываются липидными бислоями, содержащими представляющие интерес транспортные белки.

Мембрана представляет собой интерфейс датчика. Первоначально флуоресцентные материалы содержатся на одной стороне липидного бислоя, соответствующей внутренней части липосом, из которых они состоят. Каждый резонатор адресуется с помощью мультиспектрального флуоресцентного считывания.

Непрозрачный верхний слой блокирует флуоресцентные сигналы из буферного резервуара, что делает биочип совместимым с инвертированными флуоресцентными микроскопами. С помощью атомно-силовой микроскопии равномерно расположенные отверстия пор и шероховатость поверхности слоя диоксида кремния были измерены на расстоянии 3,6 нанометра, что является оптимальным для слияния везикул. Сканирующая электронная микроскопия показывает поперечное сечение через нанопору, которая имеет доступ к фемтолитровым полостям внутри кремниевого чипа.

В этом видео показана подготовка протеолипосом, подготовка чипов к анализу и основное выполнение анализа. Подключите промытую этанолом круглодонную колбу к роторному испарителю. Высушите липидную пленку в течение 40 минут при давлении 300 миллибар, температуре водяной бани 30 градусов Цельсия и максимальной скорости вращения, чтобы сформировать однородную липидную пленку на стеклянной стенке колбы.

Затем с помощью высоковакуумного насоса просушите липидную пленку еще 30 минут при комнатной температуре. Далее добавьте в колбу пять миллилитров буфера и восемь промытых этанолом стеклянных шариков, чтобы получилась многослойная пузырька. Подключите колбу к роторному испарителю и вращайтесь без разрежения при температуре 50 градусов Цельсия на максимальной скорости.

Через 45 минут раствор будет выглядеть молочного цвета, без остатков липидной пленки на стенках. Перенесите колбу под инертным газом в ультразвуковую ванну, и обработайте ее ультразвуком в течение четырех минут при комнатной температуре. Ультразвуковая обработка разрушает липосомы, делая их униламеллярными.

Теперь разделите раствор LUV на один миллилитр аликвот и выполните пять циклов замораживания и размораживания с использованием жидкого азота и водяной бани при температуре 40 градусов Цельсия. Это приводит к разрыву, перестройке и росту липосом. На последнем этапе заморозки храните все образцы при температуре минус 80 градусов по Цельсию.

Перед восстановлением аликвоты LUV выдавите липосомы, пропустив аликвоту через 400-нанометровую поликарбонатную фильтрующую мембрану 17 раз с помощью мини-экструдера. Затем дестабилизируйте LUV, добавив 4% Triton X-100 для 0,25% раствора. Выдерживайте смесь в течение пяти минут при температуре 50 градусов Цельсия.

Теперь смешайте одну часть очищенного, модифицированного MscL с 20 частями липосом, насыщенных детергентом, и продолжайте инкубацию в течение 30 минут. После инкубации возьмите 100 микролитров аликвоты, и добавьте по одному объему 30 миллимолярного кальцина. Выдерживайте эту смесь в течение пяти минут при температуре 50 градусов Цельсия.

Теперь удалите моющее средство с обработанного кальцином и необработанного образца. Добавьте в каждую из них влажные биогранулы в буфере Tris и инкубируйте их в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия на вращающейся тарелке. Перед началом эксперимента протестируйте препарат с помощью анализа активности.

Для начала смешайте эластомерную основу с отвердителем и полностью высушите смесь, чтобы она стала ужасной. Клей необходимо использовать в течение 30 минут после его готовности. Тем временем, соблюдая меры предосторожности, очистите покровное стекло с помощью пяти миллилитров хлороформа, нанесенного из стеклянного шприца, и дайте предметному стеклу высохнуть.

Теперь с помощью пипетки объемом 10 микролитров нанесите приготовленный клей на покровное стекло. Затем осторожно удалите скол с вафельной платы с помощью тонкого пинцета. Подняв скол покрытой стороной вверх, нанесите его на клей и аккуратно вотрите в предметное стекло, чтобы равномерно распределить клей.

Не допускайте попадания пузырьков воздуха внизу или попадания клея сверху на сколот. Кроме того, сделайте сборку так, чтобы она помещалась в восьмикамерный держатель затвора. Теперь высушите узлы в течение двух часов при температуре 65 градусов Цельсия в шкафной сушилке.

Позже удалите защитный слой на стружке с помощью нескольких смывов растворителем при температуре 54 градуса Цельсия. Сначала поместите смонтированные чипсы в держатель затвора. Затем инкубируйте их в трех ваннах с растворителем по 10 минут каждая.

Изопропанол, ацетон и изопропанол. Далее тщательно и тщательно промойте чипсы ультрачистой водой. Завершите процесс, высушив чипсы под слабой струей газообразного азота.

Теперь приготовьте липкую горку на восемь лунок и положите ее на скамейку задом наперед. Затем осторожно поднимите и прижмите крышку салазок к липкому предметному стеклу так, чтобы стружка была обращена к лункам. Дайте сборке отдохнуть несколько минут, прежде чем продолжить.

Прежде чем приступить к анализу транслокации, тщательно промойте узел микросхемы, как описано в текстовом протоколе, и в завершение уложите буферную ванну Tris. Затем замените раствор ванны на буфер DOPEd Tris, содержащий пять миллимоляров хлорида кальция и один микромолярный краситель Oy647. Затем добавьте протеолипосомы в камеру чипа для получения конечной концентрации один миллиграмм на миллилитр и подождите один час.

Через час четыре раза промойте чипсы 400 микролитрами буфера Tris без кальция. Теперь добавьте контролируемый краситель в каждую лунку до пяти микромоляров и приступайте к анализу. Затем установите держатель чипа на эпифлуоресцентный микроскоп и сфокусируйтесь на краю нанопористого чипа, чтобы найти микрополости.

Как только микрополости будут в фокусе, отсканируйте массив нанопор на предмет области, которая демонстрирует самый высокий коэффициент потолка. Подробности указаны в текстовом протоколе. Липосомы были подготовлены и проверены на их распределение по размерам и дисперсию.

Подготовленные липосомы были больше диаметра пор для анализа, что имеет существенное значение. Также желательны монодисперсные липосомы. Перед началом эксперимента модифицированный белок MscL в препарате липосомы был проверен с помощью флуоресцентного анализа.

Соотношение липосом, содержащих активный модифицированный MscL, было достаточным для проведения эксперимента по транслокации. На биочипе наблюдалась транслокация растворенного вещества флуоресцентной мишени по модифицированному каналу MscL. Химический модулятор MTSET был использован для открытия спроектированных каналов MscL с помощью электростатического отталкивания.

Отслеживалось последующее снижение флуоресценции внутри полостного пространства. Этот процесс оказался высоковоспроизводимым, с очень постоянными событиями оттока. Результирующие кривые оттока сгруппированы в две отдельные популяции, соответствующие одноканальным или многоканальным событиям транслокации.

Система смогла отслеживать до трех уникальных флуоресцентных красителей с анализом в режиме реального времени. Это способствует точному распознаванию положительных результатов, моноэкспоненциальных событий оттока, сложной кинетики, липидных интрузий и разрывов мембран. После освоения этот метод может быть выполнен в последовательные этапы, а именно подготовка чипа, подготовка образца, визуализация и анализ, что делает весь протокол модульным.