Мембранные процессы переноса анализироваться Высококвалифицированные параллельной системы нанопор чип Разрешение одного белка

Общая цель данной платформы на базе чипа с наноструктурами заключается в анализе функций мембранных белков на уровне отдельных молекул высокопараллельным способом. Благодаря способности разрешать отдельные белки удается получить новые представления о мембранном транспорте и потоках. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области изучения мембранных белков, такие как проводимость или транспортное поведение одиночных каналов или транспортеров, особенно тех, которые переносят неэлектрогенные субстраты.

Основным преимуществом данного метода является высокая степень параллелизма, обеспечиваемая архитектурой чипа с наноструктурами, который содержит сотни тысяч нанопор, а также флуоресцентная регистрация событий транспорта. Применение этой методики позволяет создавать наиболее эффективные библиотеки анализов для мембранных белков, поскольку платформа на базе чипа обеспечивает высокопараллельную и автоматическую запись процессов транспорта.

Как правило, специалисты, впервые использующие данный метод, быстро осваивают представленную технику. Основной целью было создание удобного для пользователя анализа, чтобы любой заинтересованный исследователь мог его внедрить. В данном анализе мембранного транспорта используется кремниевая пластина на изоляторе, изготовленная методом реактивного ионного травления.

Из каждой пластины изготавливают около 1 000 аналитических чипов. Каждый чип содержит 250 000 микрополостей. Эти полости герметизируются липидными бислоями, содержащими исследуемые транспортные белки.

Мембрана представляет собой интерфейс сенсора. Первоначально флуоресцентные вещества сосредоточены с одной стороны липидного бислоя, что соответствует внутренней части липосом, из которых он состоит. Каждая полость доступна для анализа с помощью мультиспектрального считывания флуоресценции.

Непрозрачный верхний слой блокирует флуоресцентные сигналы из резервуара с буфером, что делает биочип совместимым с инвертированными флуоресцентными микроскопами. С помощью атомно-силовой микроскопии было установлено, что равномерно расположенные отверстия пор и шероховатость поверхности слоя диоксида кремния составляют 3,6 nanometers, что является оптимальным для слияния везикул. Растровая электронная микроскопия демонстрирует поперечный разрез нанопоры, которая открывает доступ к фемтолитровым полостям внутри кремниевого чипа.

В данном видео показаны этапы приготовления протеолипосом, подготовки чипов для анализа и выполнение основного анализа. Подключите колбу с круглым дном, промытую этанолом, к роторному испарителю. Высушивайте липидную пленку в течение 40 минут при давлении 300 millibar, температуре водяной бани 30 °C и максимальной скорости вращения для формирования гомогенной липидной пленки на стеклянной стенке колбы.

Затем с помощью высоковакуумного насоса подсушите липидную пленку в течение дополнительных 30 минут при комнатной температуре. Далее добавьте в колбу пять миллилитров буфера и восемь стеклянных шариков, промытых этанолом, для получения мультиламеллярных везикул. Подсоедините колбу к роторному испарителю и вращайте без вакуума при 50 °C на максимальной скорости.

Через 45 минут раствор станет мутно-белым, а на стенках колбы не останется остаточного липидного слоя. Перенесите колбу в условиях инертного газа в ультразвуковую баню и подвергните воздействию ультразвука в течение четырех минут при комнатной температуре. Соникация разрушает липосомы, делая их одноламеллярными.

Теперь разделите раствор LUV на аликвоты по 1 мл и проведите пять циклов замораживания-оттаивания, используя жидкий азот и водяную баню при 40 °C. Это приведет к разрыву, перестройке и росту липосом. После последнего этапа замораживания храните все образцы при -80 °C.

Перед реконституцией аликвоты LUV проведите экструзию липосом, пропустив аликвоту через поликарбонатную фильтрующую мембрану с размером пор 400 нанометров 17 раз с помощью мини-экструдера. Затем дестабилизируйте LUV, добавив 4% Triton X-100 до достижения концентрации 0.25% в растворе. Инкубируйте смесь в течение пяти минут при температуре 50 градусов Цельсия.

Теперь смешайте одну часть очищенного модифицированного MscL с 20 частями липосом, насыщенных детергентом, и продолжите инкубацию в течение 30 минут. После инкубации возьмите аликвоту объемом 100 µL и добавьте один объем 30 мM кальцина. Инкубируйте эту смесь в течение пяти минут при 50 °C.

Теперь удалите детергент из образцов, прошедших кальцинационную обработку и не подвергавшихся ей. Добавьте в каждый образец влажные биосферы (bio-beads) в трис-буфере и инкубируйте их в течение ночи при температуре 4 °C на ротаторе. Перед началом эксперимента проверьте препарат с помощью анализа активности.

Для начала смешайте основу эластомера с отвердителем и полностью высушите смесь до достижения необходимого состояния. Готовый адгезив следует использовать в течение 30 минут. Тем временем, соблюдая меры предосторожности, очистите покровное стекло, используя 5 mL хлороформа, нанесенного из стеклянного шприца, и дайте стеклу высохнуть.

Теперь с помощью дозатора на 10 µL нанесите подготовленный адгезив на покровное стекло. Затем осторожно снимите чип с платы с помощью тонкого пинцета. Положите чип адгезивной стороной вниз на адгезив и аккуратно прижмите его к предметному стеклу, чтобы равномерно распределить адгезив.

Не допускайте попадания пузырьков воздуха под чип или клеящего вещества на его поверхность. Также убедитесь, что сборка подходит для держателя предметных стекол с восемью камерами. Теперь высушите сборки в течение двух часов при 65 °C в сушильном шкафу.

Затем удалите защитный слой с чипов, несколько раз промыв их растворителем при 54 °C. Сначала поместите закрепленные чипы в держатель для предметных стекол. Затем инкубируйте их в трех растворительных ваннах по 10 минут в каждой.

Изопропанол, ацетон и изопропанол. Затем осторожно и тщательно промойте чипы ультрачистой водой. Завершите процесс, высушив чипы под слабой струей газообразного азота.

Теперь подготовьте восьмилуночный адгезивный предметное стекло и положите его тыльной стороной на лабораторный стол. Затем осторожно поднимите и прижмите покровные стекла к адгезивному стеклу так, чтобы чипы были обращены к лункам. Перед продолжением работы дайте конструкции отстояться в течение нескольких минут.

Перед проведением анализа транслокации тщательно промойте узел чипа, как описано в текстовом протоколе, завершив процедуру погружением в раствор Tris-буфера. Затем замените раствор в ванночке на Tris-буфер с DOPE, содержащий 5 мМ хлорида кальция и 1 мкМ красителя Oy647. Далее добавьте протеолипосомы в камеру чипа до конечной концентрации 1 мг/мл и выждите один час.

Через час четыре раза промойте чипы 400 мкл Трис-буфера без кальция. Затем добавьте в каждую лунку контрольный краситель до концентрации 5 мкМ и приступите к анализу. После этого закрепите держатель чипа в эпифлуоресцентном микроскопе и сфокусируйтесь на краю нанопористого чипа, чтобы найти микрополости.

После того как микрорезонаторы окажутся в фокусе, просканируйте массив нанопор в поисках области с наивысшим коэффициентом заполнения (ceiling ratio). Подробности приведены в текстовом протоколе. Липосомы были подготовлены, после чего было проверено их распределение по размеру и дисперсность.

Подготовленные липосомы были больше диаметра пор, используемых в анализе, что является критически важным. Также желательно, чтобы липосомы были монодисперсными. Перед началом эксперимента модифицированный белок MscL в составе липосом был проверен с помощью анализа флуоресцентного деквенчинга.

Доля липосом, содержащих активный модифицированный MscL, была достаточной для проведения эксперимента по транслокации. На биочипе наблюдалась транслокация флуоресцентной мишени через модифицированный канал MscL. Для открытия модифицированных каналов MscL посредством электростатического отталкивания использовали химический модулятор MTSET.

Затем контролировали последующее снижение флуоресценции внутри полости. Этот процесс оказался высоковоспроизводимым с очень стабильными событиями эффлюкса. Полученные кривые эффлюкса разделились на две отчетливые группы, соответствующие событиям транслокации через один канал или через несколько каналов.

Система позволила отслеживать до трех уникальных флуоресцентных красителей с анализом в режиме реального времени. Это способствует точному разграничению положительных результатов, моноэкспоненциальных событий эффлюкса, сложной кинетики, липидных интрузий и разрывов мембраны. После освоения данная методика может выполняться последовательно — а именно: подготовка чипа, подготовка образца, визуализация и анализ, что делает весь протокол модульным.