Эффективное протокол Изоляция для B и Т-лимфоциты из небных миндалин человека

Общая цель этой процедуры заключается в получении фракций лимфоцитов BNT из образцов миндалин человека. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области вирусологии, например, какова роль фракций БТ-лимфоцитов в патогенезе вирусных заболеваний в течение трех часов после их хирургического удаления. Транспортируйте ткань миндалин в лабораторию в 50-миллилитровой центрифужной пробирке, наполненной ледяными, стерильными добавками, содержащими HBSS.

Затем с помощью соответствующих процедур биобезопасности рекомендуется работать с человеческими тканями. Смочите ткань свежей добавкой, содержащей HBSS, и перенесите миндалины на 60-миллиметровую пластиковую пластину для культивирования клеток на льду. С помощью щипцов удалите все видимые сгустки крови или жировые и соединительные ткани, а затем перенесите миндалины в новую 60-миллиметровую пластину, содержащую пять миллилитров HBSS с добавками.

Далее разрезаем. Ткань миндалин слипается на фрагменты размером от 3 до 10 миллиметров, после чего фрагменты плавно переносятся в пластиковый клеточный фильтр размером 100 микрометров в новую 60-миллиметровую клеточную культуральную пластину, содержащую 10 миллилитров свежего HBSS с добавками, используя плунжерный конец пластикового шприца. Выдавите фрагменты ткани через клеточный фильтр, убедившись, что фрагменты миндалин остаются полностью погруженными в HBSS после того, как вся ткань будет мацерирована, выбросьте ситечко и переложите полученную клеточную суспензию в пластиковую центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров на льду.

Доведите клеточный раствор до конечного объема 35 миллилитров с помощью свежих добавок, содержащих HBSS, а затем добавьте 10 миллилитров градиентного раствора плотности комнатной температуры в несколько 50-миллилитровых конических пробирок. Аккуратно наложите клеточные суспензии поверх градиентов плотности, стараясь не смешивать растворы, а затем разделите клетки центрифугированием. Мононуклеарные клетки будут разделяться на пушистый белый слой на границе с эритроцитами, фибробластами и клеточными остатками, расположенными в осадке на дне пробирки.

С помощью пипетки объемом 10 миллилитров осторожно соберите слой мононуклеарных ячеек и вытяните мононуклеарные ячейки в новую 50-миллилитровую пробирку. Затем трижды промыть клетки в 25 миллилитрах ледяного PBS на каждую промывку и повторно суспендировать последнюю гранулу в 15 миллилитрах PBS. После подсчета количества жизнеспособных клеток поместите клетки на лед, чтобы изолировать тонсорные Т-клетки путем разделения магнитными шариками.

Раскрутите суспензию мононуклеарных элементов и повторно суспендируйте гранулу в 80 микролитрах ледяного буфера для разделения из расчета один умножить на 10 на семь ячеек. Затем перенесите клеточную суспензию в стерильную двухмиллилитровую пробирку и инкубируйте в 20 микролитрах CD три магнитных антитела в течение одного часа при четырех градусах Цельсия при непрерывном щадящем перемешивании, чтобы сохранить клетки и суспензию в конце инкубации, переложите клетки в 15-миллилитровую пробирку, содержащую пять миллилитров ледяного сепарационного буфера и промойте их во время промывки. Прикрепите магнитный сепаратор к подставке и загрузите на магнит колонну.

Промойте колонку 500 микролитрами ледяного буфера для разделения, а затем поместите на нее сетчатое фильтр 40 микрометров. Теперь снова суспендируйте клеточную гранулу в 500 микролитрах свежего разделительного буфера и загрузите ячейки через сетчатое фильтр на колонку, собирая В-ячейку, содержащую ЭИТ, в коническую форму объемом 15 миллилитров. Два бон льда, когда все клетки пройдут в пробирку для сбора.

Промойте колонку четыре раза 500 микролитрами разделительного буфера на один умножить на 10 на семь ячеек, ожидая, пока резервуар колонки опустеет, прежде чем наносить следующую промывку. После последней промывки переложите колонку в новую сборную пробирку объемом 15 миллилитров. Затем с помощью поршня колонки вдавить два миллилитра разделительного буфера через колонку в трубку для сбора CD трех положительных Т-клеточных фракций.

Чтобы проанализировать выделенные фракции клеток B и t-тонсора, гранулируйте три положительные и CD три отрицательные клеточные фракции и промойте оба набора клеток в одном миллилитре PBS с добавлением 0,2% BSA или PBSA после второго спина. Распределите 100 микролитров аликвот клеток и PBSA в соответствующее количество пробирок для факсимильной маркировки и добавьте соответствующее количество конъюгированных моноклональных или контрольных антител фторчетырех или контрольных антител в каждую пробирку. Затем кратковременно сделайте трубки вихревыми и инкубируйте их в течение 30 минут при температуре четыре градуса Цельсия в темноте в конце инкубации.

Промойте пробирки два раза свежим PBSA, а затем зафиксируйте окрашивание клеток 1%-ным параформным альдегидом, чтобы обнаружить наличие ДНК аденовируса в клетках методом ПЦР. Проводят амплификацию ПЦР в соответствующих условиях циклирования, разделяя полученные продукты амплификации ПЦР на геле 1,5% АГРОС и буфере ЭДТА между слоями жил. Наконец, визуализируйте полученные полосы с соответствующим окрашиванием нуклеиновой кислотой.

Согласно стандартным протоколам, успешное разделение мононуклеарных клеток тонзора приводит к получению высокоочищенных субпопуляций лимфоцитов BNT, что подтверждается проточным цитометрическим анализом с использованием антител anti CD 20 и anti CD two для выявления популяций b- и t-лимфоцитов соответственно. В противоположность этому, неэффективное разделение мононуклеарных клеток приводит к образованию клеточных фракций, которые представляют собой смесь клеток как b, так и t-лимфоцитов. Субпопуляции, ДНК и РНК могут быть выделены из разделенных магнитными шариками b- и t-лимфоцитов для последующего анализа, как показано выше.

Например, здесь специфическое обнаружение ДНК аденовируса в лимфоцитах типа TONSOR T, обнаруженное с помощью ПЦР, показано качественно цитоплазматическим. РНК также может быть выделена из выделенных тонзорных В-НТ-лимфоцитов. После того, как два образца миндалин могут быть обработаны в течение шести часов, если техника выполнена правильно.

При попытке выполнить эту процедуру важно как можно быстрее обработать образцы миндалин. Количество ступеней промывки и объем промывочного буфера также являются важными параметрами для хорошего результата. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как QPCR и R-T-Q-P-C-R, чтобы ответить на дополнительные вопросы о количественном присутствии вирусной ДНК и мРНК после ее развития.

Этот метод проложил путь исследователям в области вирусологии к изучению патогенеза и латентности различных видов вирусов в лимфоидных тканях человека. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выделить фракции лимфоцитов БТ из образцов миндалин человека. Не забывайте, что работа с непроверенными материалами человеческого происхождения, такими как кровь и ткани, может быть чрезвычайно опасной.

Поэтому следует придерживаться соответствующих по технике безопасности практик.