Поколение и культура крови вырост эндотелиальных клеток из периферической крови человека

Общая цель этого протокола заключается в надежном получении эндотелиальных клеток кровного роста из периферической крови человека. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области сосудистой биологии, например, как дисфункция эндотелиальных клеток способствует сердечно-сосудистым заболеваниям, включая легочную артериальную гипертензию или болезнь фон Виллебранда. Основным преимуществом данной методики является то, что она последовательно генерирует стабильную популяцию эндотелиальных клеток нароста крови из небольшого объема взрослой периферической крови Продемонстрирует методику Кристофер Ванг, аспирант моей лаборатории и лаборант профессор Николас Моррелл.

Для начала этой процедуры. Для каждого донора добавьте по три миллилитра цитрата натрия в каждую из двух 50-миллилитровых конических пробирок центрифуги. Затем добавьте в каждую пробирку по 30 миллилитров собранной крови.

Аккуратно переверните трубочки два-три раза для перемешивания. Далее разведите 60 миллилитров крови с DPBS в соотношении один к одному, наклоните пробирку, содержащую градиент плотности. Центрифугирование среды под углом 20 градусов с рабочей поверхностью с помощью пипетки и серологической пипетки объемом 25 миллилитров.

Медленно налейте сверху на среду 21 миллилитр разбавленной крови. После этого центрифугируйте образцы при 400-кратном G в течение 35 минут при комнатной температуре с помощью ускорителя и отломите Во время центрифугирования восстановите раствор коллагена в концентрации 50 мкг на миллилитр путем разбавления исходного материала. Тип один коллаген на 10 миллилитров 0,02 моляра уксусной кислоты стерильный.

Перед применением процедите коллагеновую суспензию. Далее добавьте 7,5 миллилитров раствора коллагена в колбу для клеточных культур T 75. Дайте покрыть колбу в течение одного часа при комнатной температуре.

После одного часа нанесения покрытия аспирируйте раствор коллагена и нанесите 10 миллилитров DPBS в колбу, чтобы смыть остатки уксусной кислоты. Отсадите DPBS и повторите промывку еще раз. Затем добавьте в колбу пять миллилитров среды для генерации BOEC, чтобы коллагеновое покрытие не высыхало до тех пор, пока клеточная суспензия не будет готова к покрытию.

После центрифугирования с градиентом плотности тщательно соберите охристый слой с помощью стерильной пластиковой пипетки для переноса и избегайте переноса градиента плотности среды. При сборе охристой шерсти должно быть получено примерно 20 миллилитров целовой суспензии и плазмы из каждой пробирки. После этого разбавьте суспензию мононуклеарных клеток в DPBS в соотношении один к одному и переверните для смешивания, затем центрифугируйте при комнатной температуре в течение 20 минут при 300-кратном перегрузке с максимально выставленным тормозом и ускорителем после центрифугирования, аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки, добавив один миллилитр среды для генерации BOEC к каждой грануле и многократно пипетируя вверх и вниз, стягивайте все клеточные суспензии вместе и доливайте общий объем до 10 миллилитров с оставшейся средой.

Чтобы получить оценку общего количества клеток, разведите 10 микролитров клеточной суспензии с 490 микролитрами раствора Турка для воздействия на эритроциты. Затем подсчитайте 10 микролитров образца разведенной клеточной суспензии с помощью гемоцитометра. Затем поместите клеточную суспензию в одну колбу Т 75, покрытую коллагеном.

Сверху средний объем до 15 миллилитров на колбу и культуру. Ячейки при температуре 37 градусов Цельсия во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2. Теперь меняйте среду каждые два дня, добавляя 15 миллилитров свежего BOEC поколения, среду в культуру на выходные, смену среды можно отложить до каждые три дня.

Следите за колбой для культуры BOEC с седьмого по 14-й день на предмет появления колоний выроста. Определите колонии как кольцевые группы клеток, демонстрирующие классическую эндотелиальную морфологию булыжника. После того, как колония или несколько колоний будут идентифицированы в колбе, продолжайте вносить изменения в среду и дайте колониям вырасти примерно до 1000-2000 клеток на колонию.

Перед упаковкой определите количество клеток в колонии с помощью грубой визуальной оценки. Затем пройдите клетки, дважды промыв колбы 10 миллилитрами ДПБС. Добавьте пять миллилитров одного х трипсин в ЭДТА и инкубируйте в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут.

Через пять минут нейтрализовать трипсин 10 миллилитрами среды, содержащей FBS и ввести клетки в состояние суспензии с повторным пипетированием. Далее центрифугируйте суспензию при 300-кратном G в течение пяти минут. Ресуспендируйте клетки в 15 миллилитрах свежей среды BOEC и поместите всю клеточную суспензию в новую колбу T 75 без коллагенового покрытия. Продолжать.

Среда меняется до тех пор, пока клетки не сличатся и не пройдут. Ячейки, как описано ранее, для продолжения упаковочной пластины. Не менее 750 000 клеток на колбу T 75, так как низкая плотность клеток может привести к прекращению размножения BO eecs.

При этой процедуре трипсин просматривает клетки и центрифугирует их при 300-кратном G в течение пяти минут. После этого отсадите снат и ресуспендируйте клетки в 10 миллилитрах среды. Соберите образец клеточной суспензии объемом 10 микролитров и выполните ручной подсчет клеток.

Затем снова центрифугируйте образец и повторно суспендируйте его в ледяной криоконсервирующей среде в соотношении от двух до 10 до шести клеток на миллилитр. Добавьте 0,5 миллилитра клеточной суспензии в каждый флакон и поместите флаконы в ледяной сосуд для криоконсервации изопропанола. Затем поместите сосуд в морозильную камеру с температурой минус 80 градусов Цельсия не менее чем на два часа, прежде чем переводить на жидкий азот.

Чтобы разморозить ячейки, добавьте 10 миллилитров предварительно подогретой среды в коническую центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров. Удалите клетки из жидкого азота и разморозьте на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия с легким помешиванием, пока во флаконе не не останется только небольшой кристалл льда. Затем добавьте содержимое флакона по каплям в коническую пробирку центрифуги и вращайте при 300-кратном G в течение пяти минут.

Впоследствии аспирируйте надосадочную жидкость и суспензируйте клеточную гранулу. Добавьте клеточную суспензию в колбу Т 75 и долейте среду до 15 миллилитров. На этом изображении колонии выростов, которые выглядят как скопления эндотелиальных клеток, расположены в булыжном монослое и распространяются радиально от центральной точки, окружающей колонии вырастания, являются адгезивными моноцитарными клетками, которые составляют подавляющее большинство клеток в ранних культурах.

Ниже приведено репрезентативное иммунофлуоресцентное изображение иммуноса Bo Oecs, окрашенного антителом против маркера поверхности эндотелиальных клеток CD 1 44. А на этом изображении Boecs представляли собой иммуноокрашивание антителом против гликопротеина крови фактора фон Виллебранда. После освоения эта техника может быть выполнена менее чем за два часа, если ее правильно выполнить.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что образцы крови обрабатываются как можно скорее, желательно в течение двух часов после сбора. После этой процедуры клетки могут быть использованы для изучения функции эндотелиальных клеток в норме и при заболеваниях или перепрограммированы в индуцированные флурные потенцирующие стволовые клетки для использования в исследованиях дифференцировки, моделировании заболеваний или клеточной терапии после их развития. Этот метод проложил нам путь к изучению влияния мутаций в рецепторе костного морфогенетического белка второго типа на патогенез легочной артериальной гипертензии как в эндотелиальных клетках артериального роста пациента пациента, так и в мышечных клетках настроения.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как генерировать и характеризовать стабильный рост эндотелиальных клеток крови из небольшого объема периферической крови. Не забывайте, что работа с непроверенной человеческой кровью может быть чрезвычайно опасной, поэтому во время выполнения этой процедуры всегда следует надевать средства индивидуальной защиты, включая перчатки и лабораторный халат.