Выделение и анализ состава растительных липидов кутикулы полиэфирные мономеры

Сосудистые растения опираются на внеклеточные слои, которые функционируют как водонепроницаемые барьеры между растительными тканями и внешней средой. Эти липофильные клетки, будучи связанными структурами, ограничивают патогенную инфекцию и регулируют пассивный транспорт газов, воды и растворенных веществ в растительные ткани и из них. Одним из важных барьеров является кутикула растения, сложная структура, уникальная для растений.

Кутин представляет собой нерастворимый глицеринлипидный полиэфир, который составляет структурную матрицу кутикулы и связан с экстрагируемыми растворителем восками. Здесь мы представляем надежную методику для определения состава липидных полиэфиров и удержания де липидных растительных тканей. В соответствии с этим протоколом образцы целой ткани собираются, гомогенизируются и исчерпывающе разрушаются с помощью серии экстракций растворителем для удаления растворимых липидов, включая кутикулярные и эпивоски.

Триглицерин в мембранных липидах. Затем образцы деполимеризуются в входящие в них липидные мономеры с помощью метилового лизиса, катализируемого оксидом метамфетамина. Реагенты для моделирования добавляются к трансметилгидроксильным группам в соответствующие производные триметильных клеток, пригодные для газового хроматографического анализа.

Затем остатки производных переносят во флаконы с GC и загружают в A-G-C-M-S для анализа, генерируя хроматограмму, характеризующую мономерный состав биополиэфиров. Присутствует в экстрагированных образцах. Здесь мы собираем образцы цельных листьев дикого вида и двух мутантов зрелых растений arabidopsis ANA.

Для извлечения и анализа добавьте 0,5 грамма ткани в чистые стеклянные пробирки, которые были предварительно промыты хлороформом. Поместите 100 миллилитров изопропанола в колбу и добавьте бутилированный гидрокситолуол с концентрацией 0,01%.BHT - это антиоксидант, добавляемый для защиты двойных связей и жирных кислот от окисления во время экстракции растворителем. Разогрейте растворитель на водяной бане примерно до 85 градусов.

Добавьте 25 миллилитров нагретого изопропанола на грамм растительной ткани и инкубируйте образцы в теплом LOC при 85 градусах в течение 15 минут. Дайте трубкам остыть до комнатной температуры и используйте защиту для ушей и глаз. Наконец, измельчите образцы с помощью гомогенизатора для получения однородного дисперсионного уплотнения пробирок с завинчивающимися крышками и встряхните при 100 об/мин для одного-двух образцов центрифуги при 800 G в течение 10 минут.

Чтобы отделить органическую фазу от материалов с более высокой плотностью, спрессованных в гранулы, удалите надосадочную жидкость с помощью пастера или пропента. Будьте осторожны, чтобы не потревожить гранулы. Добавьте равное количество изопропанола при комнатной температуре и встряхивайте образцы в течение ночи.

При 100 об/мин центрифугируйте образцы и выбросьте надосадочную жидкость. Добавляю 25 миллилитров раствора два к одному из хлороформа, метанола, перграмма ткани, встряхиваю образцы на ночной центрифуге и отбрасываю органическую фазу. Затем повторите этот процесс, используя один-два раствора метанола хлороформа.

Высушите гранулу в течение ночи и перенесите пробирки из вытяжного шкафа в вакуумный влагопоглотитель, содержащий безводный сульфат кальция, для обезвоживания образцов в течение не менее трех дней или до достижения постоянной массы. После того, как образцы полностью высушены, они готовы к дефлорации метализом оксида метализа метализа оксида метамфетамина. Добавьте два раствора внутренних стандартов в пробирки, содержащие сухие ткани, с помощью стеклянного шприца, начиная с 25 микролитров метилHETO деканоата, и 25 микролитров омега пентека и лактона.

Чтобы инициировать глубокую полимеризацию, добавьте в образцы 0,9 миллилитра метилацетата, затем 1,5 миллилитра катализатора оксида метамфетамина натрия и 3,6 миллилитра метанола. При инкубации образцов при температуре 60 градусов в течение двух часов с периодическим вихревым движением в реакционной системе сложные липидные полиэфиры вступают в реакцию с анионами нуклеофильного оксида метамфетамина с образованием нестабильных тетраэдрических промежуточных продуктов, которые легко диссоциируют на жирные кислоты, метиловые эфиры и оксидные анионы. Эти оксиды представляют собой сопряженные основания и вступают в реакцию с метанолом, регенерируя катаически активные анионы IDE метамфетамина, тем самым поддерживая дополнительные реакции глубокой полимеризации.

Если в системе присутствует вода, она вступает в реакцию с оксидом метамфетамина натрия с образованием гидроксида натрия. Прочная основа, которая необратимо превращает полиэфиры в нежелательные свободные жирные кислоты. Вместо FAS для предотвращения гидролиза добавляется метилацетат, чтобы удалить любой гидроксид натрия в системе.

Дайте трубкам остыть до комнатной температуры. После инкубации извлеките мономеры, добавив 10 миллилитров метилендихлорида в каждую пробирку. Затем добавьте 1,5 миллилитра ледяной кислой кислоты для подкисления образцов.

Заполните пробирки 0,5 молярным раствором хлорида натрия, тщательно перебейте и центрифугируйте в течение минут. Под вытяжным шкафом. Осторожно перенесите нижнюю органическую фазу с помощью пипетки в чистые предварительно промытые пробирки среднего размера.

Снова промойте образцы солевым раствором вихревым раствором и центрифугируйте в течение 10 минут. Удалите верхнюю водную фазу, затем добавьте безводный сульфат натрия в образцы в качестве сушильного агента для удаления следовых количеств воды, оставшейся в растворе вихревой пробы центрифуги, и переведите растворитель в чистые предварительно промытые пробирки небольшого размера, загрузите пробирки в азотный испаритель для испарения растворителя и получения сухих остатков мономеров. С помощью стеклянного шприца добавьте 100 микролитров пурина и 100 микролитров B-S-T-F-A для преобразования гидроксильных групп в летучие производные триметиловых клеток.

Инкубируйте образцы при 100 градусах в течение 10 минут. Дайте трубкам остыть и испариться под воздействием газообразного азота. Добавьте 500 микролитров раствора ГЕПТАНОВОГО толуола один к одному к остаткам красного цвета, которые затем кратковременно центрифугируют.

Перенесите производные образцы во флаконы с ГХ, содержащие вкладыши объемом 400 микролитров. Поместите флаконы в газовый хроматограф, который вводит их в капиллярную колонку для анализа, элюаты затем детектируются четырехкратным масс-спектрометром. Необработанные данные, полученные с помощью анализа GCMS, обрабатываются и представляются в виде хроматограммы для каждого образца.

Отдельные мономеры, соответствующие различным хроматографическим пикам, идентифицируются по их удельным масс-спектрам. Во время удержания GC количество отдельных мономеров определяется с помощью внутреннего стандартного метода количественного определения, что позволяет сравнивать распространенность и состав мономеров между образцами. Здесь представлены наложенные хроматограммы из репрезентативных анализов мономеров, высвобожденных из ткани листа абсцесса кролика, соответствующей дикому типу, и двух мутантных аллелей гена, кодирующего фермент P 50 50 монооксигеназы, демонстрирующих отчетливые мономерные профили.

Наши результаты демонстрируют значительные различия, обилие трех основных кутинов, мономеров и растений дикого типа и мутантных растений арабидопсиса. Этот протокол представляет собой надежный метод определения состава растительных липидных полиэфиров путем выделения, идентификации и количественного определения составляющих их мономеров. Процедура является масштабируемой и может быть легко адаптирована для обработки больших количеств различных растительных материалов, включая корни, семена, листья и другие цельные ткани.

Этот метод применим к исследованиям, изучающим биосинтез, регуляцию и распределение кутина и суберина в высших растениях.