Измерение физиологических реакций Drosophila Сенсорными нейронами липид феромонов с использованием живых визуализации кальция

Общая цель этой процедуры заключается в измерении физиологических реакций вкусовых нейронов дрозофилы на липидные феромоны. Этот метод может быть использован для ответа на ключевые вопросы сенсорной нейробиологии, такие как идентификация лигандов для орфанных вкусовых рецепторов. Основное преимущество этой методики заключается в том, что реакции отдельных вкусовых нейронов могут быть изучены у неповрежденного, живого животного.

После обезболивания мухи прикрепите ее к покровному листу толщиной 0,17 миллиметра, используя очень маленькую каплю прозрачного лака для ногтей. Прикрепите боковую сторону ширинки к предметному стеклу, используя всю каплю. Затем под рассекающим микроскопом с помощью влажной кисти удлините переднюю лапу мухи.

Затем с помощью двух очень тонких полосок ленты закрепите первый и пятый сегменты предплюсны на покровном листе. Если необходимо визуализировать нейроны на хоботке, поместите еще одну тонкую полоску ленты поверх рострума хоботка, чтобы обнажить лабеллум. Теперь сделайте короткую стенку вокруг мухи с помощью ручки PAP.

Дайте анестезии истечь в течение получаса, прежде чем проводить измерения. Для этого протокола готовят необходимые разведения из расчета один миллиграмм на миллилитр стокового раствора лиганда, используя PBST. Чтобы начать процедуру, наложите 10 микролитров PBST на закрепленные и открытые сегменты предплюсны.

Это увлажняет ногу и предотвращает ее смещение из фокуса. Затем сфокусируйтесь на сегментах с помощью оптической системы, которая может получить хороший флуоресцентный сигнал с быстрым временным разрешением, такой как вращающийся дисковый конфокальный микроскоп с камерой sCMOS. Соберите три Z-стека для предварительной стимуляции интересующих нейронов в тарсальном сегменте.

В этом примере изображения захватываются с экспозицией 200 миллисекунд и группированием два на два на участке размером шесть микрон на полмикрона каждые две секунды. Обязательно оптимизируйте мощность лазера, чтобы свести к минимуму фотообесцвечивание и при этом обеспечить высокое соотношение сигнал/шум. Здесь 491-нанометровый 100-милливаттный лазер работает на 30% пропускания.

Сигнал должен быть обнаружен до стимуляции, но не приближаться к насыщению. Теперь нанесите пипеткой 10 микролитров раствора для стимуляции на интересующий сегмент тарзы. Во время пипетирования будьте очень осторожны, чтобы не прикасаться к ноге или телу мухи, иначе лапки сместятся с места.

Затем немедленно получите первые изображения после стимуляции и продолжайте собирать достаточное количество изображений, чтобы задокументировать максимальное изменение флуоресценции. Для анализа откройте серию конфокальных Z-стеков с помощью программного обеспечения для анализа и обработки изображений Fiji или ImageJ. Сделайте проекцию общей интенсивности всех Z-срезов для каждой из временных точек.

Здесь есть шесть срезов и 120 временных точек. Сначала выберите опцию стека под изображением, а затем выберите опцию Z-проекции. Введите единицу для начального среза и четыре для стоп-среза.

В качестве типа проекции введите срезы суммы и выберите все таймфреймы. Теперь определите область интереса, или ROI, такую как тело клетки или нейронная проекция. Используйте инструмент выделения от руки, чтобы нарисовать вокруг границ конструкции.

Затем нажмите на метку анализа и выберите опцию «Менеджер ROI» в разделе «Инструменты». Количественно оцените флуоресценцию ROI, сначала выбрав параметр «Установить измерения» в меню «Анализ». Отметьте флажки для интегрированной плотности, площади, среднего и максимального значения серого, а также для надписи.

Затем выберите опцию «Еще» в меню «Менеджер ROI» и выберите опцию «Мультимер». Теперь рассчитаем максимальное изменение флуоресценции для точки времени t. Чтобы количественно оценить флуоресценцию после интенсификации, измерьте интегральную плотность ROI.

Если t равно нулю, измерьте флуоресценцию предварительной стимуляции по изображениям ROI перед стимуляцией таким же образом. Усреднение значений из трех изображений для этого t равно нулю. Чтобы количественно оценить фоновую флуоресценцию, измерьте интегрированную плотность из области ткани, лишенной обнаруживаемых нейронов, которая имеет тот же размер и форму, что и ROI.

Соберите уникальное значение фона для каждой точки времени. Кальциевый индикатор GCamP экспрессировался с использованием двух различных паттернов экспрессии Gal4. Каждый паттерн обозначает отдельную популяцию нейронов передних конечностей и ненейрональных опорных клеток.

Для обоих паттернов экспрессии наблюдались лиганд-специфичные ответы на липофильный феромон CH503. Относительное изменение интенсивности флуоресценции сигнала GCamP увеличивалось при более высоких концентрациях CH503. Любопытно, что доза CH503 в пять нанограммов может подавить нейронный ответ.

Измеренные ответы нейронов Gr68a и ppk23 различались. Нейронная реакция нейронов, помеченных драйвером Gr68a Gal4, демонстрировала тонический паттерн, в то время как нейроны ppk23 демонстрировали фазовый, осцилляторный отклик в ноге. В хоботке нейроны ppk23 показали позднюю тоническую реакцию со стороны тела клетки и колебательную реакцию аксональной проекции.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как измерять физиологические реакции отдельных вкусовых нейронов на липидные феромоны и другие гидрофобные лиганды. Этот метод открывает исследователям в области хемосенсорной биологии путь к измерению реакций отдельных вкусовых нейронов у Drosophila melanogaster. Используя этот метод, нейронная активность может быть подавлена или активирована с помощью шибиры с регулируемой температурой или трансгена TRiP a-one путем соединения микроскопа с вращающимся диском с инкубатором на сцене с регулируемой температурой.

После освоения эта техника может быть завершена за пять минут, не считая времени, затраченного мухой на восстановление после анестезии. При выполнении этого метода важно прочно зафиксировать мушку на покровном листе, не повредив ее переднюю лапу. Во время визуализации важно получать изображения, как только передняя нога стимулируется раствором феромонов.