Высокое разрешение Количественное запаха, руководствуясь поведения в Дрозофилы Использование Flywalk Парадигма

Общая цель этого поведенческого биотеста заключается в изучении поведения уксусных мух, управляемого запахом. Fly Walk — это высокопроизводительная система, которая автоматически отслеживает и анализирует поведенческие реакции нескольких отдельных мух на обонятельные стимулы. Этот новый метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области обоняния насекомых.

Например, каков гедонистический баланс запаха или что означает добавление дополнительных ароматизаторов к этому балансу? Основное преимущество этого эксперимента заключается в том, что мы можем управлять поведением по запаху с высоким временным разрешением, и мы используем стимулы запаха, похожие на те, которые насекомые испытывают в природе, или на те, которые мы также используем в электрофизиологических записях. Как правило, люди, которые пытаются использовать этот метод, могут испытывать трудности, потому что на самом деле ему нужна герметичная система, поэтому вам нужно знать, через что воздух проходит, и вы должны быть уверены, что нет никаких утечек там, где воздух может покинуть систему. Обычная пищевая среда.

Поддерживайте комнатную температуру в диапазоне от 23 до 25 градусов по Цельсию, а относительная влажность должна составлять около 70% при приготовлении. С помощью больших культуральных флаконов делают от 20 до 30 взрослых особей в течение недели и собирают группы от 30 до 40 потомков смешанного пола для составления экспериментальной когорты. Когда когорте исполнится от двух до четырех дней, переложите ее в новый флакон, содержащий влажную поролоновую пробку или влажную папиросную бумагу.

Дайте мухам поголодать в этом флаконе в течение 24 часов до теста. Очень важно, чтобы мухи не подвергались анестезии во время этой передачи. Для такой установки 250 миллилитровых бутылок служат таким же количеством увлажнителей.

Наполните каждую бутылку 100 миллилитрами дистиллированной воды. Далее приготовьте по полмиллилитра рабочие запасы каждого одоранта в виде одного 1000 разведения чистых запахов и минерального масла. Аналогичным образом подготовьте одну ПЦР-пробирку только с минеральным маслом, которая будет служить отрицательным контролем.

Теперь подготовьте систему доставки запаха для каждого одоранта. В эксперименте. Подсоедините два шаровых обратных клапана к каждому флакону с запахом.

Убедитесь, что флаконы с запахом соединены в правильном направлении потока. Неправильное соединение не только поставит под угрозу запланированный эксперимент, но и может привести к загрязнению системы доставки. Далее проверьте систему на герметичность.

Во-первых, загерметизируйте выходное отверстие смесительной камеры. Затем проверьте, чтобы весь воздушный поток перед устройством стимула упал до нуля. Если в системе есть утечки, прислушайтесь к ним.

Обычно их можно решить путем замены резиновых прокладок в ключевых соединениях или замены тефлоновых трубок. На первом этапе этой процедуры можно вызвать беспокойство по поводу разбития стекла, поэтому наденьте защитное снаряжение. Осторожно перенесите 15 отдельных тестовых мушек в отдельные стеклянные пробирки С помощью аспиратора закройте стеклянные пробирки с обеих сторон с помощью соответствующих переходников, они должны очень плотно прилегать.

Далее подсоедините загруженные стеклянные трубки к установленной дорожке для мух. После того, как все трубки будут прикреплены, дайте мухам привыкнуть к новой среде не менее 15 минут перед началом эксперимента. Теперь включите источник света.

Убедитесь, что вы обеспечили достаточное количество света для эффективного отслеживания без повышения температуры внутри стеклянных трубок. Все флаконы с запахом должны быть соединены на этом этапе, чтобы создать замкнутую систему. Период привыкания основан на закрытой системе без утечек, поэтому поток воздуха через трубки происходит с той же скоростью, что и в периоды испытаний.

Проверьте расход воздуха на компьютере, подключите его к цифровым расходомерам. Общий поток воздуха, выходящий из системы, должен быть равен потоку воздуха, входящему в систему. Если нет, есть утечка.

Утечка повлияет на воздушный поток во всех трубках, но проблемная трубка обычно показывает наибольшее падение воздушного потока. Если обнаруживается новая утечка, она обычно вызвана сломанной внутри адаптера стеклянной трубкой или осколками стекла внутри адаптеров от предыдущих экспериментов. Во время этого процесса убедитесь, что влажность воздуха, выходящего из системы, составляет от 60 до 80%После того как мухи акклиматизируются к своим трубкам, можно проводить эксперимент.

В принципе, на данный момент может быть представлена любая последовательность запахов. Наилучшие результаты можно получить, рандомизируя стимулы и разделяя их не менее чем на 90 секунд. Всего.

Представьте каждый запах 40 раз в импульсах по 500 миллисекунд. Затем настройте область интереса, перетащив рамку через область, которую нужно отслеживать. Включите все 15 стеклянных трубок в раму, но исключите внешние пять миллиметров концов трубок.

Следующим шагом будет отключение программного обеспечения для отслеживания и внесение изменений в сценарий. Это изменит положение по оси Y 14 параллельных линий, разделяющих отдельные трубки. Когда программное обеспечение слежения снова включится, между любыми двумя линиями должна присутствовать только одна муха.

Затем убедитесь, что параметры камеры настроены таким образом, чтобы мухи надежно отслеживались по стеклянным трубкам. Если мухи теряются на краях интересующей области, увеличьте яркость или усиление программного обеспечения для слежения. Теперь, когда система полностью готова, приступайте к протоколу стимулирования.

Записывайте положения мух со скоростью 20 кадров в секунду и записывайте эти координатные положения в сочетании с состоянием клапана запаха в текстовые файлы. Поскольку эксперимент очень чувствителен к запахам, требуется регулярная чистка, чтобы очистить стеклянные трубки, замочить их в моющем средстве, а затем промыть под проточной дистиллированной водой. После полоскания просушите трубки под давлением воздуха, а затем нагрейте их до 200 градусов Цельсия в течение восьми часов.

Чтобы сначала очистить систему подачи запаха, извлеките все флаконы и трубки с запахом из центральной смесительной камеры. Затем извлеките адаптеры трубок из смесительной камеры. Очистите опорожненную смесительную камеру, промыв ее растворителем под колпаком, как и трубки.

Высушите смесительную камеру с помощью сжатого воздуха и нагрейте ее до 200 градусов Цельсия в течение восьми часов. Чтобы очистить флаконы с запахом и клапаны, снимите стальные пробки, выбросьте резиновые прокладки и снимите обратные клапаны, мыльные обратные клапаны и этанол, а также другие компоненты этанола и ацетона. Далее обработайте замоченные компоненты ультразвуком в течение 30 минут при максимальной настройке и смойте их дистиллированной водой.

Как и раньше, для сушки используйте сжатый воздух и нагревайте компоненты до 200 градусов Цельсия в течение восьми часов. Промывайте их этанолом Когда ацетон находится по направлению потока воздуха, потому что ацетон атакует резиновые детали, немедленно просушите каждый промытый обратный клапан сжатым воздухом, чтобы удалить все остаточные запахи с промытых обратных клапанов. Пульсируйте воздухом через них в течение нескольких дней, установите их в инкубатор с температурой 60 градусов Цельсия с пульсирующим потоком воздуха с интервалом в одну секунду.

15 голодающих самок мух подвергались воздействию этилбутирата. Желтая полоса обозначает пульсацию запаха. Синими квадратами обозначено движение против ветра в пределах 100 миллисекунд.

Соответственно, красные квадраты изображают движение по ветру. Те же мухи также демонстрировали движение против ветра в ответ на стимуляцию изоп пентилацетатом, этилацетатом или двумя тремя бутанами, усредненными к популяции. Реакция мухи на этилацетат имела резкое начало, высокую амплитуду и короткую продолжительность.

Напротив, реакция на два бутана Диона имела более позднее среднее начало, меньшую амплитуду и более длительную продолжительность. В конечном счете, данные от каждого одоранта были обработаны таким образом, а затем дополнительно проанализированы, чтобы показать, что все четыре запаха вызывают большее смещение против ветра в течение четырех секунд, чем растворитель. Кроме того, открывая флаконы с одорантом, мухи синхронно подвергались воздействию всех возможных смесей.

После стимуляции мух четырьмя отдельными запахами, стимуляция смесями четырех запахов была, по крайней мере, столь же привлекательной, как и наиболее привлекательное отдельное соединение в смеси. Как только вы освоите, вы можете запустить этот эксперимент в течение одного часа, а затем он будет продолжаться в течение восьми часов, и уже через 30 минут вы сможете визуализировать свои первые результаты. Таким образом, этот метод действительно позволяет получить данные от многих мух за короткое время с высоким временным разрешением.

Но будьте осторожны. Этот эксперимент требует тщательной очистки между экспериментами. Если ваш организм все еще заражен муравьями из последнего эксперимента, вы можете забыть о своих результатах во время прогулки мухой.

Конечно, вы также можете протестировать генетически модифицированных мух, с помощью которых вы можете исследовать влияние отдельных или заводских нейронных цепей на поведение, управляемое OD. После разработки этой новой техники она проложила нам путь к исследованиям в этой области, фракции насекомых, чтобы понять кодирование этих запахов в мозге насекомого. И, что важно, использование одного и того же вида стимуляции для поведения при ходьбе мухой и для физиологического эксперимента означает, что мы действительно можем сравнивать эти две разные экспериментальные парадигмы.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как наладить хождение мух, и вы должны быть в состоянии провести этот эксперимент у себя на коленях и вскоре начать свои собственные высокопроизводительные эксперименты по насекомым. Но не забывайте, что работа со стеклянной посудой и химическими веществами может быть крайне опасной, поэтому всегда надевайте лабораторный халат. Используйте защитные очки и перчатки.