Новый подход, который исключает обслуживание для изучения агрессии и "проигравший" Эффект
30 декабря 2015 г.
Во фруктов летать бои, поведенческие паттерны наблюдается, бороться динамику, и связано обучения и памяти находятся под влиянием экспериментальных условиях. Протокол, представленные здесь описывает новый порядок, что полностью исключает обработку мух в ходе экспериментов. Это улучшает динамику и позволяет бороться формирование сильных "неудачник" эффектов.
Общая цель данного метода заключается в том, чтобы инициировать возникновение эффектов «проигравшего» и «победителя» у Drosophila melanogaster, исключив манипуляции с мухами из поведенческой процедуры. Большинство исследований поведения животных, проводимых в лабораторных условиях, предполагают физический контакт с животными. Манипуляции с животными, в свою очередь, обычно вызывают у них стресс, который может помешать проведению поведенческих исследований. Данный метод направлен на устранение стрессового воздействия при работе с животными.
Мы разработали новую камеру для изучения агрессии у плодовых мушек, которая полностью исключает необходимость манипуляций с животными до, во время или после экспериментов. Благодаря использованию этих новых камер все измеренные нами поведенческие параметры улучшились. Применение данного метода позволяет минимизировать поведенческую вариативность между особями.
Мы сокращаем время, необходимое для установления четких иерархических отношений доминирования, и смогли вызвать выраженное психологическое состояние проигравшего и победителя. Эти камеры просты в использовании и могут быть многофункциональными для изучения различных форм поведения дрозофил. Для начала эксперимента выращивайте и поддерживайте линии мух в инкубаторе с 12-часовым циклом свет/темнота при температуре 25 °C и относительной влажности 50%.
Затем подготовьте пробирки для изоляции, нагревая свежий корм для мушек до тех пор, пока он не расплавится. С помощью пастеризованной пипетки перенесите примерно 1,5 миллилитра расплавленного корма в отдельные пустые стеклянные пробирки и с помощью тонкой кисти помогите корму затвердеть. Осторожно извлеките самца-куколку на поздней стадии развития из стоковой пробирки и поместите его на стенку пробирки со свежеприготовленным кормом.
Закройте пробирки для изоляции ватой и поместите их в инкубатор. После изоляции мухи готовы к окрашиванию. Анестезируйте муху углекислым газом, затем аккуратно зафиксируйте ее с помощью тонкой зубочистки.
Нанесите небольшую точку акриловой краски на грудной отдел, избегая попадания краски на голову, крылья, брюшко или ноги. Дайте краске высохнуть в течение примерно 10 секунд, после чего осторожно перенесите мух обратно в исходные пробирки для изоляции. Поместите пробирки для изоляции обратно в инкубатор.
Продолжите подготовку оборудования, нагревая свежую среду для мух до полного расплавления. С помощью пастеревской пипетки перенесите 0,8 мл среды в крышку флакона с винтовым затвором и дайте среде остыть. После того как среда остынет.
Нанесите небольшую каплю свежей дрожжевой пасты в центр поверхности кормушки. Перед каждым использованием промывайте аппарат и отдельные камеры для сражания водой, затем просушите их бумажным полотенцем. Далее нанесите каплю клея на кормушку и поместите её в центр каждой камеры для сражания.
Накройте камеры для борьбы крышкой аппарата. Поместите закрытый аппарат под источник света и установите видеокамеру над конструкцией. Начните поведенческие эксперименты, вставив пластиковые разделители в каждую камеру для борьбы.
Извлеките ватный тампон из пробирки с изолированной мухой и поместите пробирку под открытое отверстие на боковой стороне аппарата. Позвольте мухе переместиться в камеру для сражения за счет отрицательного геотаксиса. Затем закройте раздвижную стенку. После того как первая муха окажется в камере, повторите процедуру, чтобы ввести вторую муху в камеру для сражения с другой стороны аппарата.
Затем верните аппарат в позицию для видеосъемки с освещением. Начните видеозапись и удалите пластиковый разделитель, чтобы мухи могли взаимодействовать в рамках экспериментов по изучению эффекта проигравшего. Записывайте первые бои в течение 20 минут для обеспечения формирования устойчивых иерархических отношений доминирования.
Через 20 минут осторожно верните пластиковый разделитель в боевые камеры, чтобы разделить мух, и остановите запись видео. Чтобы сформировать устойчивый менталитет проигравшего, убедитесь, что в ходе первого боя между мухами установились и поддерживались отношения доминирования, а затем при вставке разделителей для разделения насекомых максимально минимизируйте воздействие на животных. После 10 минут отдыха начните запись и осторожно извлеките пластиковый разделитель.
Оставьте мух взаимодействовать еще на 20 минут. Остановите запись через 20 минут, чтобы завершить эксперимент. Извлеките мух из поведенческих камер по отрицательной оси Z, выполнив процедуру, описанную перед использованием нового метода наблюдения за первыми драками, в обратном порядке.
В среднем первая встреча наблюдается через две минуты. Первый выпад происходит через четыре минуты, а иерархия доминирования у мух устанавливается через восемь минут. В течение оставшихся 12 минут отношения доминирования закрепляются.
По мере того как победители становятся все более агрессивными, а проигравшие — все более склонными к отступлению. Новый подход был использован для количественной оценки «эффекта проигравшего» — процента особей, потерпевших поражение в первом бою, которые проигрывают и во втором бою. Значимый эффект наблюдался, когда проигравшие ранее особи в своих вторых боях сталкивались со знакомыми или незнакомыми победителями.
При выполнении данной процедуры важно помнить, что анализ агрессии следует проводить на самцах мух в возрасте от шести до семи дней, выращенных в условиях социальной изоляции. После освоения методики данные камеры позволяют легко осуществлять помещение, мониторинг, взаимодействие и разделение мух без какого-либо физического воздействия, что вызывает выраженный эффект проигравшего. Использование разделителей для изоляции мух после первого боя позволяет вносить вариации в экспериментальный протокол.
Мы можем оставить победителей и в следующем бою объединить их с другими противниками, чтобы вызвать эффект победителя. С небольшими изменениями те же камеры можно использовать для изучения ухаживания, локомоции и других социальных форм поведения плодовой мушки. После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как проводить тесты на агрессию и как вызвать эффект проигравшего без манипуляций с мухами до и во время экспериментов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен новый метод изучения агрессии у плодовых мушек путем исключения манипуляций с объектами, что снижает уровень стресса и улучшает показатели поведения. Новая конструкция камеры повышает достоверность измерения эффектов победителя и проигравшего у Drosophila melanogaster.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Поведенческая биология
- Поведение животных
Теоретические основы
- Манипуляции с животными могут вызвать стресс, что влияет на результаты поведенческих исследований.
- Традиционные методы часто предполагают перемещение животных, что приводит к вариативности результатов.
- Изучение агрессии у Drosophila позволяет получить представление о поведенческой динамике.
- Исключение манипуляций с животными может привести к более точной оценке поведения.
Цель исследования
- Разработать метод, минимизирующий стресс у плодовых мушек во время исследований агрессии.
- Изучить влияние манипуляций с объектами на поведенческие результаты.
- Повысить достоверность измерения поведения, связанного с агрессией.
Используемые методы
- Разработка новой камеры для исследований агрессии.
- Устранение необходимости манипуляций с объектами до, во время и после экспериментов.
- Измерение различных поведенческих параметров у Drosophila.
- Сравнение результатов с традиционными методами манипуляции.
Основные результаты
- Поведенческие параметры улучшились при использовании нового метода.
- Наблюдалось снижение вариабельности между особями.
- В отсутствие манипуляций были отмечены более выраженные эффекты проигравших.
- Общая динамика боев была усилена.
Выводы
- Новая конструкция камеры эффективно снижает уровень стресса у плодовых мушек.
- Исключение манипуляций с объектами позволяет получить более надежные поведенческие данные.
- Данный метод может быть применен в дальнейших исследованиях поведения животных.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данный метод решает одну из ключевых проблем поведенческой нейробиологии: минимизацию экспериментальных погрешностей, вызванных манипуляциями с животными. За счет исключения ручного вмешательства данный подход повышает надежность данных при изучении зависимых от опыта поведенческих изменений, таких как эффект проигравшего и победителя. Это обеспечивает более точную валидацию мишеней в процессах нейроповеденческого поиска, где поведенческие показатели служат основой для формулирования механистических гипотез.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать влияние генетических и средовых факторов на пути, связанные с агрессией, без искажающего воздействия стресса, вызванного манипуляциями.
- Операционная ценность: снижает поведенческую вариабельность между особями, повышая чувствительность анализа при выявлении незначительных фенотипических изменений.
- Прогностическая ценность: способствует снижению рисков при работе с мишенями, участвующими в процессах обучения, памяти и социального поведения, обеспечивая более чистые поведенческие показатели.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Обеспечивает стандартизированную, воспроизводимую платформу для количественной оценки динамики агрессии и формирования социальной иерархии.
- Практическая ценность: Облегчает выполнение рабочих процессов, совместимых с высокопроизводительным скринингом, за счет автоматизированного ввода мух посредством геотаксиса и разделения камер с помощью слайдеров.
- Готовность анализа: Позволяет получать количественные данные, такие как латентный период начала боя, частота выпадов и время установления доминирующих отношений, для применения в скрининге соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная значимость: позволяет изучать связанные с опытом поведенческие изменения, которые моделируют аспекты психических расстройств, связанных с социальным поражением и реактивностью на стресс.
- Механистическое снижение рисков: позволяет изолировать специфические нейронные цепи или молекулярные пути, способствующие формированию эффекта проигравшего, без помех, вызванных манипуляциями с животными.
- Доклиническая преемственность: обеспечивает возможность лонгитюдного поведенческого мониторинга на протяжении нескольких раундов боев для оценки адаптивной или дезадаптивной поведенческой пластичности.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в рабочие процессы раннего этапа поиска, где поведенческие фенотипы используются для валидации мишеней, влияющих на функцию нейронных цепей и поведенческую регуляцию. Он обеспечивает стабильное фенотипирование перед переходом к исследованиям механизмов действия или терапевтического вмешательства.
- Открывающая биология: позволяет проверять гипотезы о влиянии генов или препаратов на агрессию, социальную память и пути стрессового ответа.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные поведенческие показатели, необходимые для сравнения генетических или фармакологических условий.
- Аналитика: позволяет измерять временные поведенческие параметры (например, время начала драки, частоту выпадов, установление доминирования) для определения зависимости «доза-эффект» или корреляций «генотип-фенотип».
- Трансляционные исследования: связывает данные с доклиническими моделями за счет фиксации этологически значимого социального поведения, отражающего консервативные механизмы стресса и обучения.
- Корпоративное повторное использование: конструкция камеры адаптируема для изучения других аспектов социального поведения Drosophila, что повышает ее полезность в рамках нескольких исследовательских программ.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов в поведенческих тестах за счет исключения манипуляций с животными как вмешивающегося фактора.
- Операционная ценность: Улучшает воспроизводимость и масштабируемость благодаря стандартизированным рабочим процессам без необходимости ручного перемещения объектов.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) при валидации мишеней за счет снижения количества ложноположительных результатов, вызванных стрессовым поведенческим шумом.
- Влияние на портфель: Обеспечивает более точную приоритизацию мишеней на основе надежных поведенческих фенотипов в системах, релевантных для конкретных заболеваний.
Особенности реализации
- Требуется опыт в разведении Drosophila, поведенческом наблюдении и видеофенотипировании.
- Зависит от наличия систем трекинга поведения и средств контроля условий окружающей среды (циклы свет/темнота, температура, влажность).
- Необходима стандартизация между лабораториями в отношении настройки камер, изоляции мух и определения временных интервалов поведенческих эпох.
- Адаптация метода для других модельных систем может потребовать модификации механизмов входа, основанных на геотаксисе.
- Практические ограничения включают ограничения по размеру камер и зависимость от подвижности мух для самостоятельного перемещения в арены.
