РНК-интерференции-опосредованного управления афлатоксинов в арахисовом: метод анализа микотоксинов, производство и трансгенных выражение в Арахис / Aspergillus Pathosystem

Общая цель данной работы заключается в том, чтобы предоставить надежный, точный, недорогой и быстрый метод проверки эффективности опосредованного РНК-интерференцией сайленсинга генов синтеза афлатоксинов аспергилл в трансгенном арахисе с использованием минимального количества семян, обычно для эффективного количественного определения афлатоксинов в образцах требуются сотни граммов семян. Основное преимущество этой методики заключается в том, что при этом используется менее пяти семян для тестирования той или иной обработки за 10 дней до подготовки семян, устанавливают культуру афлатоксина положительного aspergillus flavus NR RL 3 3 5 7 в шнековой среде ZAP Pex. Выращивают эту культуру при температуре 25 градусов по Цельсию.

Он будет использоваться для инокуляции семян. После подготовки трансгенных растений, экспрессирующих РНК, что подробно описано в текстовом протоколе, приступайте к сбору их семян. Сначала удалите пекарпа с помощью истирания из мойки высокого давления, установленной на низкий уровень, или соскребите пекарпа вручную.

После того, как перикарп будет удален, определите цвет мезокарпа, поместив стручки на доску для зрелости в соответствующие группы. Теперь удалите отверстия и обработайте желтые и коричневые семена отдельно. Рассчитайте количество семян, необходимых для эксперимента, по крайней мере, три семенных кусочка, то есть на каждую отбираемую линию арахиса требуется три половинки сосвинца.

Дно стерильного стакана накройте слоем семян, а затем просто накройте семена отмеренным объемом 75% этанола. Затем удвойте этот объем. Дайте семенам поинкубироваться в растворе в течение 30 секунд, а затем промойте их в стерилизованной дистиллированной воде.

Далее обработайте семена объемом 2%-ного гипохлорита так же, как это делают с F-этанолом. Дайте этой инкубации продолжаться в течение пяти минут. Затем используйте три полоскания в пятикратном объеме стерилизованной дистиллированной воды.

Чтобы удалить гипохлорит, крайне важно, чтобы весь раствор гипохлорита был смыт на этом этапе. Теперь семена стерилизуются на поверхности. Далее увлажните семена, погрузив их в стерилизованную дистиллированную воду на два часа, подготовленную для того, чтобы положить увлажненные семена на стерильную чашку Петри.

На этом этапе все материалы должны быть стерилизованы. Удалите оболочки семян с помощью щипцов, затем отделите кохайн. Наконец, удалите эмбрионы с помощью скальпеля.

Эмбрионы могут быть выброшены или использованы для регенерации новых растений. Далее разрежьте олеин пополам скальпелем и погрузите половинки и стерилизованную дистиллированную воду до тех пор, пока они не будут готовы к инокуляции. Затем промокните лишнюю воду из половины свинца на стерильных бумажных полотенцах и поместите кусочки семян в отдельные 1,5%-ные шнековые пластины с углублениями размера семян и заправьте в них семена срезанными сторонами вверх, чтобы инокулировать половинки сосвинца.

Добавьте на поверхности разреза два микролитра по 10 000 спор аспергилл на микролитр суспензии. Не допускайте, чтобы суспензия стекала по бокам половинки семени. Наконец, поместите посуду в темный инкубатор при температуре 30 градусов Цельсия на один-четыре дня, пока она не будет проверена.

Через один день, через два дня и через три или четыре дня возьмите образцы семян, аккуратно удалите случайно выбранные инокулированные половинки по мере необходимости. С помощью салфетки протрите лишние споры и шнек и поместите образец в стеклянный флакон с завинчивающейся крышкой. Перенесите неинокулированные образцы в двухмиллилитровые пробирки для анализа R-T-P-C-R.

Освободите образцы в жидком азоте и храните замороженные образцы в морозильной камере до тех пор, пока они не будут обработаны. Для анализа на афлатоксин при необходимости возьмите инокулированный свинец в половине кроватки в стеклянном флаконе с завинчивающейся крышкой объемом четыре миллилитра. Образец будет стабильным в течение многих месяцев при температуре минус 80 градусов по Цельсию.

Когда семена будут иметь комнатную температуру, извлеките образец, добавив четыре объема метанола и дав пробиркам инкубироваться в течение ночи в темноте при комнатной температуре без перемешивания. На следующий день сначала выполните UPLC, подготовьте мини-колонку из пропилена объемом 1,5 миллилитра с подходящей фриттой. Затем добавьте 200 миллиграмм оксида алюминия.

А далее вставляем еще одну фритту. Следующая позиция, флакон пробоотборника A-U-P-L-C автоматически помещается под мини-колонку и находится в контакте с ней, чтобы свести к минимуму испарение. Теперь добавьте 0,5 миллилитров метанольного экстракта из образца в одноразовый стакан два не пластиковых.

Затем добавьте в пробирку 0,5 миллилитра ацетонитрила и перемешайте растворы пипеткой. Теперь нанесите 0,5 миллилитра смеси на подготовленную мини-колонку и соберите ВНО только под действием силы тяжести. После того, как EIT будет быстро собран, прикрепите септическую крышку к флакону для сбора для использования на UPLC.

Поместите флаконы в A-U-P-L-C уже подготовленными с помощью подвижной фазы испытания воды, метанола и ацедонита. Затем количественно оцените содержание афлатоксина в ЭИТ. Более подробную информацию см. в текстовом протоколе, а также в анализе УПЛК.

Поместите кусочки семян, используемые для экстракции, в отдельные стеклянные флаконы. Затем лиофилизируйте флаконы в течение ночи и измерьте сухой вес образца ткани утром, чтобы концентрация афлатоксина могла быть выражена в нанограммах на грамм образца. Затем достаньте образцы из морозилки и добавьте триол и измельчите замороженные ткани с помощью гомогенизатора бисерной мельницы при 3,100 об/мин в течение 40 секунд и приступайте к выделению РНК вектора RNAI, несущего небольшие фрагменты пяти генов синтеза афлатоксина из флависа, который был использован для трансформации растений арахиса.

Идентификационные номера соответствуют обширным номерам аннотаций генома института из 99 регенерированных трансформантов, семь ПЦР-положительных линий были клонированы и протестированы в соответствии с описанием. Все семь показали снижение накопления афлатоксина на 60-100% по сравнению с контрольными линиями. Представлены результаты по двум из семи линий.

Эти две линии РН AI показали наличие двух выбираемых маркеров NPT. Согласно результатам S-T-N-P-C-R, отрицательным контролем была использована ПЦР-отрицательная линия, которая прошла процесс трансформации для проверки линий РНК-интерференции на их способность противостоять афлатоксинам свежесобранной кедии положительного афлатоксина. После инкубации на срок до 96 часов на половину свинца NRRL 3, 3, 5, 7 наносили на половину свинца, в которой отсутствовал эмбрион, и семенники.

Инокулированные ткани обрабатывали с использованием UPLC для измерения уровня афлатоксина, как описано. Эти результаты были в дальнейшем подтверждены жидкостной хроматографией, масс-спектрометрией. В целом, РНК-интерференция 2 88 72 показала снижение содержания афлатоксина В-2 на 94-100% и снижение афлатоксина В-100% по сравнению с контролем.

В то время как РНК 2, 88, 74 показала снижение обоих афлатоксинов на 60-100%. После этой процедуры те же экстракты семян могут быть использованы для анализа фито Синь, чтобы лучше понять реакцию семян на грибковую инвазию. Этот метод также предоставит уникальный инструмент, который поможет разработать технологию RNAI для контроля микотоксинов.