Измерение рН фагосомы по Логометрический флуоресцентной микроскопии

Общая цель этой серии экспериментов — измерить phaco somal pH в живых клетках с помощью метрической флуоресцентной микроскопии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии фагоцитов, такие как идентификация ключевых молекул во взаимодействиях патогенов или влияние генетических нарушений или лекарств на фагоцитоз. Основное преимущество этого метода заключается в том, что в отличие от популяционных методов, таких как факты или спектроскопические эффекты, такие как изменения в миграции связывающихся частиц или в гетерогенности отдельных фагосом, могут быть обнаружены.

Применение этого метода распространяется на наши методы лечения патогенных химических организмов, потому что многие из этих микроорганизмов могут изменять pH фрагозо, чтобы избежать отвлечения внимания внутри фагосом. Чтобы начать эту процедуру, добавьте 20 миллиграмм высушенного Ксана в 10 миллилитров стерильного вихря PBS и нагрейте на кипящей водяной бане в течение 10 минут. Затем охладите и центрифугируйте при 2000 G в течение пяти минут.

После этого удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте Ксан в одном миллилитре PBS. Обрабатывайте его ультразвуком в течение 10 минут на водяной бане. Затем ультразвуком перенесите 500 микролитров ресуспендированного ксана в две 1,5-миллилитровые пробирки и центрифугируйте их при давлении 11 000 G в течение пяти минут.

Повторите промывку с 500 микролитрами PBS. Затем дважды промыть Ксан в 500 микролитрах свежеприготовленного 0,1 молярного раствора карбоната натрия при pH 9,3 и РЕСУСПЕНДИРОВАТЬ в 490 микролитрах раствора карбоната натрия после окончательной промывки. Впоследствии добавьте в вихрь Xan 10 микролитров растворенного в ДМСО в соотношении 10 миллиграммов на миллилитр.

Накройте пленкой и выдерживайте с перемешиванием в течение четырех часов при комнатной температуре Чтобы удалить несвязанный глаз, сначала промойте его 0,5 миллилитрами ДМСО плюс 150 микролитрами PBS, включая ультразвуковую обработку между этапами промывания. Затем умывайтесь 0,5 миллилитрами ДМСО плюс 300 микролитрами PBS, затем умывайтесь 0,5 миллилитрами ДМСО плюс 450 микролитрами PBS, а затем только PBS. После этого добавьте один микролитр Ксана на 500 микролитров PBS и вортекс.

Затем добавьте 10 микролитров разбавленного xma-песка к краю камеры гемоцитометра, где он встречается с крышкой, установите гемоцитометр на светлопольный микроскоп, оснащенный объективом 20 х. Сосредоточьтесь на верхнем левом углу, содержащем 16 квадратов, и посчитайте все частицы рождественского песка в этой области. Используя счетчик подсчета рук, повторите ту же процедуру в правом нижнем углу.

Затем рассчитайте концентрацию Xan с помощью этого уравнения. Затем опсонизируйте меченный Xan антителом против анти-Xan в вихре разведения от одного до 100 и инкубируйте образец в течение одного часа на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. Впоследствии подсчитайте рождественский песок с помощью гемоцитометра, после чего разбавьте его до 100 умножить на 10 до шестой частички на миллилитр.

Выделив первичные нейтрофилы мыши, добавьте два раза по 10 к пятой части нейтрофилов в центр стеклянной посуды с дном диаметром 35 миллиметров. Затем распределите каплю, добавив 50 микролитров среды, и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение пяти минут, чтобы позволить клеткам прилипнуть. После этого добавьте один миллилитр HBSS теплого до 37 градусов Цельсия, содержащего ингибитор миелопероксидазы.

Установите чашку на широкопольный флуоресцентный микроскоп, оснащенный системой нагрева с температурой 37 градусов Цельсия и 40-кратным масляным объективом. Инкубируйте клетки без визуализации в течение 10 минут, чтобы клетки и оборудование могли прийти в равновесие. Затем отрегулируйте настройки микроскопа, чтобы получить яркопольное изображение пропускания с возбуждением 440 нм или 490 нм и излучением 535 нм каждые 30 секунд.

Через две минуты добавьте 10 раз по 10 к шести из-за фитзи зы песка в центр чашки и продолжайте визуализацию в течение 30 минут. Через 30 минут остановите покадровую съемку и запустите таймер. Перемещайте рабочую область и делайте 10 или более снимков в разных полях зрения, чтобы запечатлеть другие зоны вага в течение пяти минут.

При этой процедуре разморозьте калибровочные растворы и нагрейте до 37 градусов Цельсия на водяной бане. Проверьте pH с помощью pH-метра и запишите его. Затем установите перистальтический насос на чашку со стеклянным дном перед получением изображения.

Затем проведите видеомикроскопию в реальном времени по истечении 30-минутного периода сбора данных. Включите насос, чтобы удалить раствор из чашки. Впоследствии добавьте один миллилитр первого калибровочного раствора и остановите насос.

Подождите пять минут, пока сигнал стабилизируется. Повторяйте эту процедуру с каждым калибровочным раствором. Для анализа таймлапс-фильмов и фагосомных снимков откройте изображения с изображением J. Вычтите фон в канале 490, нарисовав небольшой квадрат ROI в области без ячеек.

С помощью инструмента выделения квадратного полигона и кликаем по плагинам. Затем вычитание BG. Загрузите тот же ROI на канал 440, нажав редактировать.

Затем выделение с последующим восстановлением выделения и повторение процедуры вычитания фона. Создайте изображение канала 490 с 32-битным коэффициентом, разделенное на канал 440, сначала щелкнув мышью. Затем калькулятор изображений.

После этого выберите подходящие изображения в выпадающих меню «Изображение один» и «Изображение два». Выберите «Разделить» в выпадающем меню операции и установите флажок «32-битный результат». После этого измените таблицу поиска цветовой кодировки на цветовую кодировку, совместимую с соотношением, щелкнув изображение, а затем вверх таблицы.

Затем радужный RGB. Установите порог для изображения с соотношением, чтобы удалить нулевые и бесконечные пиксели, щелкнув по изображению. Затем отрегулируйте и укажите порог.

Отрегулируйте полосы прокрутки так, чтобы Xan отображался красным цветом, и нажмите «Применить», а затем убедитесь, что установлен флажок «Установить пиксели фона для nan». Если значения фона и сигнала Xan дают очень похожие значения соотношения, что приводит к зашумленному изображению соотношения, добавьте небольшое количество фона обратно в канал 440, щелкнув процесс. Затем математика.

Затем добавьте, затем переделайте изображение соотношения, чтобы получить более чистый результат. В качестве альтернативы можно опустить вычитание фона по 440 каналам. Затем объедините этот стек соотношений со светлым каналом в многоканальный композит, щелкнув цветом изображения.

Затем объедините каналы. Выберите светлопольное изображение в выпадающем меню серого канала и изображение соотношения в выпадающем меню зеленого канала. Затем установите флажок «Сохранить исходные изображения».

После этого отсканируйте покадровые фильмы или снимки, сравнивающие светлое поле и каналы соотношения, чтобы определить, какие фагосомы следует проанализировать, нарисуйте ROI вокруг фагосом с помощью инструмента выбора овального полигона и добавьте их в менеджер ROI, щелкнув инструменты анализа. Затем менеджер ROI, а затем сложить, затем измерить их коэффициент интенсивности Xan, нажав на более мультимер, и снимите флажок с одного строки на срез. Для цейтраферной съемки.

Отслеживать зоны FGA можно по одной, рисуя ROI типа control M для измерения каждой временной точки и перемещения ROI при необходимости для отслеживания значений интенсивности с течением времени. Затем скопируйте измерения из окна результатов в электронную таблицу, чтобы преобразовать значения флуоресценции в pH. После измерения отношения 490 к 440 для фагосом в калибровочных покадровых фильмах в электронной таблице нанесите диаграмму значений отношения с течением времени.

Затем рассчитайте средние значения отношения для всех фагосом в поле зрения в пяти временных точках в середине периода времени, соответствующего каждому калибровочному раствору pH. Отобразите эти средние значения отношения от 490 до 440 относительно фактически измеренного pH, объединив не менее трех независимых калибровок в один график. Затем проведите нелинейный регрессионный анализ, чтобы получить уравнение для преобразования значений отношения к pH.

На этом рисунке показано, как различаются фагосомы и проглоченный Ксан. На левой панели отображается объединенное изображение светлого поля и соотношение 490 к 440 по Фитц-зи. В то время как правая панель показывает только светлопольное изображение.

Фагосомы можно отличить от внешних частиц, которые либо не локализуются совместно с клетками, либо флуоресценция которых не совпадает с темным центром, окруженным более ярким кольцом, характерным для фагосом на показанном светлом изображении. Вот типичные временные ходы дикого типа и высоковольтных нокаутных нейтрофилов FGA omal pH в диких типах нейтрофилов, neu нейтральный или слабощелочной pH в ранние временные точки После приема внутрь фагосомы нокаутных нейтрофилов HV CN one могут быть либо щелочными, либо кислыми. Снимки, сделанные через 30-35 минут после добавления мишеней, позволяют рассчитать средний рН популяции по большому количеству фагосом в гистограммах показанных здесь коэффициентов Фитц-Ксана.

Мы смогли увидеть различия в смальном pH между диким типом и HVCN с одним нокаутным нейтрофилом. Начиная с этапа оптимизации при попытке выполнить эту процедуру, важно помнить об оптимизации условий визуализации. Во-первых, оптимизация концентрации антител на этапе оптимизации также может быть полезной для обеспечения надежного фагоцитоза после этой процедуры.

Другие методы, такие как измерение продукции Росса или измерение уничтожения бактерий, могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, изменяется ли средний Росс или способность фагосомы убивать бактерии вместе с pH после их развития. Этот метод проложил путь исследователям в области биологии фагоцитов к изучению того, какие факторы влияют на способность фагоцитарных клеток убивать или перерабатывать проглоченные материалы для вызова дальнейших иммунных реакций. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить геометрическую флуоресцентную микроскопию с целью измерения физиологических параметров фагосом в режиме реального времени в живых клетках.

Не забывайте, что работа с ингибиторами UNIFOR и живыми клетками может быть чрезвычайно опасной, поэтому при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток.