Лазерная захвата микродиссекция человеческого эпителия простаты для анализа РНК

Общая цель этого протокола микродиссекции лазерного захвата заключается в выделении общей РНК из чистых популяций типов эпителиальных клеток предстательной железы из гетерогенных замороженных тканей предстательной железы для последующего анализа экспрессии генов. Этот метод может помочь проанализировать образцы пациентов и ответить на ключевые вопросы в области исследований рака предстательной железы, например, как экспрессия РНК отличается в образцах доброкачественных и патологических эпителиальных тканей протеза или в образцах клинических испытаний. Основное преимущество этой методики заключается в том, что микродиссекция с лазерным захватом позволяет выделять РНК однородных популяций эпителиальных или стр-клеток из замороженной ткани предстательной железы.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности с приобретением высококачественной РНК, потому что они не знают, какие шаги имеют решающее значение для поддержания РНК. Бесплатные условия Начните со сбора всех реагентов и инструментов, необходимых для процедуры. Дав замороженной ткани предстательной железы уравновеситься внутри криостата в течение 30 минут, впрысьте монтажную среду на дно кассеты и быстро установите ткань с помощью охлажденных щипцов.

Поместите кассету в охладитель криостата на пять минут, чтобы установить монтажную среду. После застывания, распылите замороженную рабочую среду на патрон и осторожно вдавите в него установленную ткань. Нижней стороной вверх.

Дайте заготовке застыть в течение пяти минут. Прежде чем поместить патрон в держатель, зафиксируйте рукоятку в нужном положении и вставьте новое лезвие в криостат. После разблокировки ручки осторожно продвигайте образец до тех пор, пока не будет достигнуто желаемое обнажение тканей.

Когда все будет готово, отрегулируйте криостат до пяти микрон и отрежьте одну или две секции. Поместите эти срезы на предметное стекло для окрашивания гематином и эоином. Немедленно поместите горку в холодный, 100% этанол на две минуты.

По истечении этого времени снимите предметное стекло и дайте ему высохнуть при комнатной температуре. Окрашенные h и d предметные стекла обеспечивают лучшую визуализацию ядерных текстур и должны использоваться патологоанатомом для обозначения областей интереса. Далее поместите рамку загона комнатной температуры.

Вставьте опору рамы, отрегулируйте криостат до 10 микрон и создайте секции. На каждом предметном стекле может быть размещено от одного до четырех секций, в зависимости от размера ткани. Сразу же погрузите горку в холодный 100% этанол.

Снимите предметное стекло через две минуты и храните в морозильной камере для последующего анализа. В тот же день, когда проводится микродиссекция лазерного захвата, достаньте предметные стекла рамки ручки из морозильной камеры, работающие в зоне, свободной от РНК. Увлажните предметные стекла, осторожно погрузив их в 90% этанол на две минуты, а затем в 75% этанол на две минуты.

После гидратации окрашивайте ткань простаты, осторожно погружая предметные стекла в 0,5% голубого цвета на срок от пяти до 30 секунд. Задержите салфетку, дважды промойте предметные стекла в глубокой воде в течение 15 секунд, а затем добавьте 75% этанол в течение 30 секунд до трех минут. Наконец, перенесите предметные стекла рамки ручки в сухой контейнер без РНК на льду.

Перед началом процедуры поместите горку сушиться на грелку для горок на 15 минут. Сушите только те предметные стекла, которые будут обрабатываться, а остальное храните на льду до тех пор, пока они не понадобятся. Включите компоненты LCM в следующем порядке.

Питание микроскопа, лазерный ключ, лазерный переключатель, а затем компьютер. Затем запустите программное обеспечение для лазерной микродиссекции с помощью программного обеспечения. Попросите микроскоп загрузить предметные стекла и пробирки для сбора.

Нажмите на кнопку «Выгрузить держатель образца» и загрузите предметное стекло на держатель предметного стекла тканью вниз. Вставьте держатель предметного стекла в соответствующее гнездо в микроскопе и нажмите «Продолжить». Далее нажмите на «Выгрузить сборные трубки».

Наклейте этикетку и загрузите пробирки на держатель пробирки и вставьте в соответствующий слот. Зафиксируйте крышки и добавьте 35 микролитров буфера для лизиса. Следите за тем, чтобы не было пузырей.

Как только колпачки коллекций будут загружены, нажмите OK. С помощью программного обеспечения выберите положение предметного стекла в держателе, а затем выберите колпачок для сбора образца. Визуализируйте и сфокусируйте слайд на компьютере с 10-кратным увеличением.

Используйте программное обеспечение для калибровки лазера, выбрав лазер. Затем откалибруйте, отрегулируйте мощность, диафрагму и скорость лазера, выбрав лазер, а затем управляйте. Продолжайте вносить коррективы до тех пор, пока лазер полностью не прорежет ткань.

Крайне важно очертить области интереса, которые обычно выполняет сертифицированный патологоанатом, чтобы точно препарировать желаемые участки ткани, подвергнутые LCM, используя разметку 8 на 11 часов и e патологоанатома в качестве визуального руководства. Используйте инструмент «Нарисовать фигуру» в программном обеспечении, чтобы очертить желаемые области эпителия на виде и избежать скопления стромы. Нажмите «Вырезать», чтобы запустить лазер.

Если область разрезана не полностью, используйте инструмент «Перемещение и вырезание», чтобы вручную пройти по ней. Продолжайте перемещать объектив на новые виды и повторяйте лазерную резку до тех пор, пока предметное стекло не будет полностью рассечено или не будет собрано нужное количество ткани. По завершении осторожно извлеките пробирки из держателя для сбора и закройте колпачки, помня о лизисе, буфере и тканях в колпачках.

Кратковременно центрифугируйте в течение 30 секунд, чтобы собрать жидкость и ткань на дне пробирки. Инкубируйте образцы при температуре 42 градуса Цельсия в течение 30 минут и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия до тех пор, пока не будете готовы к выделению РНК. В этих примерах показаны репрезентативные срезы предстательной железы, окрашенные толуидиновым синим, на предметном стекле до и после лазерного захвата специфических клеток доброкачественного эпителия.

Подтвердите специфичность захваченного лазером участка ткани. Доброкачественный эпителий и строма. Не экспрессируйте специфичный для рака предстательной железы ген A-M-A-C-R.

Строма не экспрессировала эпителиальный специфический ген и KX 3.1 во время этой процедуры. Важно помнить, что нужно работать в среде, свободной от РНК, чтобы предотвратить деградацию РНК. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выделить РНК из однородных популяций эпителиальных или штормовых клеток из замороженных тканей для многочисленных последующих методов анализа.

Не забывайте, что работа с криостатом может быть чрезвычайно опасной в плане мер предосторожности, таких как хорошая тренировка и чрезвычайно хорошее внимание к лезвию всегда должны быть при выполнении этой процедуры.